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气相色谱—质谱法测定肉制品中的9种挥发性N—亚硝胺类物质

2015-04-08何淑娟等

肉类研究 2015年1期
关键词:固相萃取亚硝胺肉制品

何淑娟等

摘 要:研究建立一种适用于肉制品中9 种挥发性N-亚硝胺含量的气质联用快速检测方法。实验优化提取溶剂和色谱柱对提取和分离检测影响的条件,同时考察4 种固相萃取单柱(酸性氧化铝、C18、活性炭、PSA)和1种双填料的混合固相萃取柱(PSA-C18)的净化效果。结果表明:本检测方法的线性系数均可达到0.999 2以上;线性范围为0~10 μg/mL;重现性良好,相对标准方差均≤3.2%;回收率为85%~98%;检测限分别为N-亚硝基二甲基胺

1.0 μg/kg、N-亚硝基甲基乙基胺2.1 μg/kg、N-亚硝基二丁基胺0.8 μg/kg;其他均为0.5 μg/kg。该方法能够满足测定肉及肉制品中N-亚硝胺的残留含量的需要。

关键词:气质联用;肉制品;N-亚硝胺;固相萃取

Determination of Nine N-Nitrosocompounds in Meat Products by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

HE Shujuan, ZHAO Limin, LI Qiang, CAI Lipeng, ZHANG Yan*

(Hebei Institute of Food Quality Supervision Research, Shijiazhuang 050091, China)

Abstract: This research has established a rapid detection method for nine volatile N-nitrosamines in meat and meat products by using gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS). In this experiment, we investigated the effect of extraction solvent type and chromatographic conditions on the extraction and separation of the target compounds. Meanwhile, comparison of solid-phase extraction (SPE) cartridges packed with acidic alumina, C18, activated carbon or PSA, or both C18 and PSA was carried out for the purification of the N-nitrosamines. Results showed that the linear range of the proposed method was

0?10 μg/mL with correlation coefficients more than 0.999 2. Good reproducibility was observed with relative standard deviation (RSD) not exceeding 3.2% and the mean recoveries were in the range of 85%?98%. The detection limits for N-nitrosodimethyl amine (NDMA), N-nitrosomethyl ethyl amine (NMEA), N-nitro sodibutyl amine (NDBA) and six other N-nitrosamines were 1.0, 2.1, 0.8 and 0.5 mg/kg, respectively. This method can meet the requirement for the determination of N-nitrosamine residues in meat and meat products.

Key words: gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS); meat products; N-nitrosamines; solid phase extraction

中图分类号:TS254 文献标志码:A 文章编号:1001-8123(2015)01-0027-04

doi: 10.7506/rlyj1001-8123-201501007

亚硝酸盐在肉制品加工中起到很好的作用,不仅可以抑制梭状肉毒杆菌的生长繁殖和产生毒素,对典型腌肉风味的产生起重要作用,还具有抗氧化的效果。但是,亚硝酸盐在腌肉中可以转化为亚硝酸,很容易和次级胺类物质反应产生致癌性物N-亚硝胺类化合物。N-亚硝胺物质一般结构为R2(R1)N—N=O,食品中N-亚硝胺主要在食品加工和贮藏过程中形成,常见于腌制、烟熏、焙烤等制品中。N-亚硝胺类化合物不仅具有致畸性和致突变性,而且对神经和肾脏有害[1-8]。

目前用于检测食品中的亚硝胺的前处理方法有很多,包括水蒸气蒸馏法[9-10]、低温真空蒸馏法[11]、溶剂液液萃取法[12]及固相萃取法[13]等。由于肉类食品的基质复杂性和食品中亚硝胺逐渐下降的趋势[14-15],因此合适的前处理提取方法对准确检测亚硝胺至关重要。

目前熟肉制品中N-亚硝胺物质的检测方法主要有气相色谱法[16]、液相色谱法[17]、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-热能分析法等[18-21]。在

GB/T 5009.26—2003《食品中N-亚硝胺类的测定方法》中气相色谱-热能分析样品前处理复杂、耗时长、仪器方法成本高,实际可操作性不强。而气相色谱-质谱联用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)是最常见的检测N-亚硝胺物质的方法。本研究选择9种常见的挥发性亚硝胺,利用GC-MS的高效分离能力和高灵敏性建立了一种适用于肉制品的快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熟制猪肉制品为市售。

N-亚硝基二甲基胺(NDMA)(纯度>99.9%) 美国Sigma公司;N-亚硝基甲基乙基胺(NMEA)、N-亚硝基二乙基胺(NDEA)、N-亚硝基吡咯烷(NDEA)、N-亚硝基吗啉(NDEA)、N-亚硝基二丙基胺(NDPA)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基二丁基胺(NDBA)、N-亚硝基二苯基(NDPhA)(纯度

均>98%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司;二氯甲烷(色

谱纯) 美国J.T.Baker公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A/MS 5973i气相色谱-质谱联用仪(配

有电子轰击离子源(EI)) 美国Agilent 公司;HGB550高速组织捣碎机 美国Waring公司;K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司;Visiprep DL固相萃取

装置 美国Supelco 公司;KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司;数显型漩涡混合器 美国Talboys公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将熟肉制品切成小块,在组织捣碎机粉碎成匀浆或粉末状均匀样品。准确称取粉碎的熟肉样品20.0 g,置于50 mL具塞离心管中,加入30 mL二氯甲烷,涡旋振荡1 min,超声提取20 min,4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min;吸取有机相层以20 mL二氯甲烷重复提取1次,合并2 次萃取相;将合并液放入100 mL鸡心瓶中,于40 ℃水浴中旋转蒸发至2 mL左右,待净化。

1.3.2 样品净化

用10 mL二氯甲烷活化固相萃取柱,将2 mL待净化样品转移至固相萃取柱,并用10 mL二氯甲烷分3 次洗脱固相萃取柱,收集所有洗脱液,于35 ℃鸡心瓶中旋转浓缩至近干,用1.0 mL二氯甲烷复溶,过0.22 μm有机膜,备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱:DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 ?m);升温程序:40 ℃保持4 min;以5 ℃/min升至100 ℃,再以20 ℃/min升至250 ℃,保持2 min;进样口温度:250 ℃;载气(N2)流速1.5 mL/min;隔垫吹扫流量:3 mL/min;不分流进样;进样量:1.0 ?L。

1.3.4 质谱条件

电子轰击离子源(EI);电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;接口温度240 ℃;离子扫描模式。上述条件下,9 种N-亚硝胺类化合物的保留时间定性及定量离子如表1所示。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的优化

考察不同极性的气相色谱柱非极性柱HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)、中等极性柱DB-1701(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)、极性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 ?m)对9 种待测N-亚硝胺类化合物分离的影响。结果表明,选用非极性柱HP-5MS时,

N-亚硝胺二甲基胺的色谱峰受溶剂峰影响大,且有色谱峰展宽的现象,峰形有拖尾现象;选用中等极性柱DB-1701时,仍有峰展宽的现象,而选用强极性柱DB-WAXETR时,获得的色谱峰峰形对称,分离度好。这是因为亚硝胺分子质量小,具有强极性和强挥发性,当使用强极性柱DB-WAXETR时有利于9 种物质很好的分离。因此,本实验选用DB-WAXETR作为色谱柱。

2.2 柱温升温速率的优化

N-亚硝胺类化合物的分子质量小、沸点低、出峰时间快,因此需要优化柱温的升温速率,以获得最佳的分离效果。选择柱温的起始温度为40 ℃,分别比较了升温速率为5 ℃/min和10 ℃/min时的分离效果,结果显示,当初期升温速率为10 ℃/min时,溶剂峰影响较大,且

N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二丙基胺的色谱峰不能很好地分开;当升温速率为5 ℃/min时,9 种物质能够很好地分开,所以选择升温速率为5 ℃/min。当柱温升至100 ℃时,较难分离的N-亚硝基二丙基胺已经出峰,此时将升温速率提高至20 ℃/min,当柱温升高到250 ℃时,待测物均已出峰。在上述优化条件下,对9 种N-亚硝胺混合标准溶液进行分析,得到标准品的总离子流图见图1。

从左至右依此为N-亚硝基二甲基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基二苯基胺。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 样品提取方法的优化

水蒸气蒸馏法操作繁琐,耗时长,适用性不强,且操作温度高,易使被测物质亚硝胺损失。赵华[22]、吴燕燕[23]等采用超声振荡提取法提取水产品中的N-亚硝胺,样品添加回收率均在70%~105%,因此本研究采用超声振荡提取法对样品进行前处理。

本研究中9 种N-亚硝胺的极性不同,因此分别选用不同极性的二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、甲醇作为提取溶剂,结果表明,以二氯甲烷作为提取溶剂时目标物的回收率最高,正己烷次之。这是因为正己烷和二氯甲烷为亲油性,乙酸乙酯为亲油性同时有一定的亲水性,丙酮、甲醇为亲水性,对于含油脂较多的熟肉制品样品,正己烷和二氯甲烷提取效率相对较高,但是正己烷的亲油性太强,对水溶性的N-亚硝基二甲基胺溶解性较差,有峰形展宽的现象,综合考虑选择二氯甲烷作为提取溶剂,经过超声法提取样品中的N-亚硝胺。

2.3.2 萃取溶剂体积的优化

在其他实验条件相同的情况下,对20.00 g空白样品加入固定质量浓度的混合N-亚硝胺标准溶液进行加标实验,比较二氯甲烷用量20、30、40、50、60 mL 5个水平的萃取效果。由图2可知,二氯甲烷体积20~40 mL时,二氯甲烷用量与色谱图对应的峰响应强度成正比;用量40~60 mL时平均峰响应强度基本不变。因此选用40 mL为萃取体积。

2.3.3 固相萃取净化柱的优化

乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine,PSA)为一种弱阴离子交换吸附剂,主要去除脂肪酸、油脂和极性色素,ODS-C18(C18)具有疏水作用,可去除油脂和非极性极强的干扰物,目前这两种填料被广泛应用于食品中农药残留检测。王秀元等[24]采用活性炭柱净化腌制水产品,对亚硝胺的回收率达87%,杨宁等[25]采用氧化铝和C18混合小柱净化腌菜中9种亚硝胺,回收率在75.7%~116.1%。

本实验对5种固相萃取柱(PSA柱、PSA-C18混合柱、C18柱、活性炭柱、酸性氧化铝柱)的净化效果进行了比较。通过样品加标实验,比较每种萃取柱分别对9 种N-亚硝胺的回收率以确定最佳的固相萃取柱。由表2可知,PSA和C18混合柱的净化效果最好,回收率可达83.43%~94.92%。这是因为肉制品中含有大量的油脂和脂肪酸,PSA和C18可以很好地去除油脂和脂肪酸,因此本实验采用PSA和C18混合柱对样品进行净化。

2.4 标准曲线和灵敏度

分别配制9 种N-亚硝胺系列质量浓度的混合标准溶液进行GC-MS测定,每个水平重复测定3 次,采用外标法进行定量,以定量离子的峰面积(Y)为纵坐标,以其质量浓度(X)为横坐标进行线性回归,得到的9 种N-亚硝胺的线性方程见表3。该方法重现性好,灵敏度高,相关系数达0.999 2以上。

2.5 回收率及精密度

3 结 论

本研究所建立的气相色谱-质谱联用法快速测定肉制品中9 种挥发性N-亚硝胺含量的分析方法,通过比较不同提取方法和不同固相萃取小柱净化效果的影响,优化了实验分析条件。较GB/T 5009.26—2003前处理简单快速,特异性强,重现性好,大幅缩短检测时间,适用于高通量分析检测N-亚硝胺类化合物,是一种易于操作,灵敏度高的测定方法。

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