陈春梅,周惠健,沈银涵,陆辰燕,刘 瑞,于 海,2,*,席 军,林广桃

(1.扬州大学旅游烹饪学院,食品科学与工程学院,江苏扬州 225000; 2.江苏省淮扬菜产业化工程中心,江苏扬州 225000; 3.江苏长寿集团有限公司,江苏南通 226000; 4.江苏省长寿特色肉制品加工工程技术研究中心,江苏南通 226000; 5.扬州星月农产品有限公司,江苏扬州 225000)

近年来,消费者对不同禽肉的需求不断增加。同样,消费者从人类健康的角度寻找高质量的肉类。从鹅肉的营养价值来看,其富含蛋白质、维生素及无机盐等,其中蛋白质含量高达22.3%,脂肪含量仅为11%,不饱和脂肪酸含量高及胆固醇含量低[1],能够很好的满足人们的健康需求。相比较其他禽肉,鹅肉在外观、质地、口感等方面都占有一定的优势。Hamadani等[2]比较了鹅肉、鸡肉和羊肉品质，发现在整体接受度方面,消费者更喜欢鹅肉。

肉在加热过程中会发生一系列变化,而这些变化是由负责肉类质量属性的蛋白质变化引起的[3]。热处理可引起肌肉结构的变化,主要是由于蛋白质的变性。变性蛋白的疏水基团暴露,导致蛋白的溶解度降低,肉的持水能力下降,影响肉的质地[4]。蛋白质降解所产生游离氨基酸不仅是重要的滋味物质,而且它们还会与其他物质继续反应产生挥发性风味物质[5]。

目前,加热对肉类品质的影响已有相关报道。万红兵等[6]发现当牛肉的中心温度高于80 ℃时,随着加热时间的延长,牛肉嫩度值会下降。李思宁等[7]使用微波加热的方式对牦牛肉进行了处理,发现在功率一致的情况下,随着加热时间的延长,牛肉的损失率和剪切力增大(P<0.05),肌纤维出现了断裂,肌束变得更加混乱。计红芳等[8]研究了加热温度对鹅肉品质的影响,发现温度升高会导致增大蒸煮损失率、破坏肌纤维结构,最终得到较低的剪切力及较高的弹性。但是,关于鹅肉在加热过程中发生的变化的研究几乎没有,因此本研究的目的就是为了模拟家庭炖煮过程中鹅肉蛋白发生的相关变化。本文研究了不同煮制时间对鹅肉对蒸煮损失率、剪切力、蛋白电泳、MFI、游离氨基酸及微观结构的影响,以揭示煮制时间对鹅肉蛋白特性的变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

一年鹅龄的扬州老鹅,重量为4～5 kg 当天购于扬州歌鹅业发展有限公司;17种氨基酸1 nmol/μL标准品(天门冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸)、OPA、FMOC 均购于Sigma公司。

Ultra Turrax T25BASIS高速匀浆机 德国IKA公司;INFINITE 200 PRO多功能酶标仪 美国Tecan公司;Sorvall ST 16R高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技公司;XL-30 ESEM环境扫描电子显微镜 荷兰Philips公司;TMS-Pro食品质构仪 美国TMS公司;SC-80C全自动色差仪 北京康光光学仪器有限公司;Gel DOC XR凝胶成像系统 美国伯乐有限公司;GC-MS联用仪(气相色谱仪TRACE 1300,质谱仪 ISQ LT) 美国Trace公司;LM 3B型数显式肌肉嫩度仪 北京天翔飞域科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 将鹅胸肉切成5 cm×5 cm×3 cm大小的块状,电磁炉设置温度为100 ℃,所有样品均冷水下锅进行焯水处理(3 min)。洗去浮沫后,使用滤纸出去多余水,在肉水比为1∶3的条件下进行煮制。分别煮制0、30、60、90、120 min进行3次重复分析测试。

1.2.2 蒸煮损失率 将样品修整后使用滤纸擦干表面水分并记录重量(m1),后将样品按照上述方法进行处理,取出处理后的样品用滤纸擦干表面水分并记录质量(m2)。根据式(1)计算蒸煮损失率。

式(1)

式中:m1为蒸煮前擦干表面水分后的质量,g;m2为蒸煮后擦干表面水分后的质量,g。

1.2.3 剪切力的测定 测定前将样品沿肌纤维方向切成10 mm×10 mm×30 mm,使用数显式肌肉嫩度仪进行测定。

1.2.4 肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳 参照Han等[9]的方法。取肉样1 g,剔除可视的结缔组织和脂肪,切碎后,加4 mL 4 ℃的缓冲溶液A(30 mmol/L K2HPO4、30 mmol/L KH2PO4、1% TritonX、2 mmol/L EDTA、0.05%β-巯基乙醇、0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟,pH6.5)低速匀浆1 min,8800×g离心15 min,去上清液。沉淀用2 mL缓冲溶液B(100 mmol/L K2HPO4、100 mmol/L KH2PO4、0.7 mol/L KI、0.05%β-巯基乙醇,pH6.5),10000×g离心20 min。肌原纤维蛋白浓度用双缩脲法测定。

将6 mg/mL肌原纤维蛋白样品与2×上样缓冲液以体积比1∶1混匀,于100 ℃下水浴10 min。采用4%浓缩胶、15%分离胶,上样量为15 μL。浓缩胶时电压90 V(30 min),分离胶时电压120 V(60 min)。停止电泳后,取下胶使用考马斯亮蓝染色溶液进行染色、摇床脱色及拍照成像。

1.2.5 MFI测定 参考Wang等[10]的方法稍作修修改。将肌肉组织在液氮中粉碎,称取0.5 g肉,30 mL 25 mmol/L磷酸盐缓冲液(100 mmol/L KCl,1 mmol/L EGTA,pH7.0)冰浴匀浆(11000 r/min,60 s,每次10 s,中间间隔10 s)。匀浆后离心(1000×g、15 min、4 ℃)并弃掉上清液,再次加入30 mL预冷的磷酸盐缓冲液将沉淀充分悬浮。再离心(1000×g、15 min、2 ℃)并弃掉上清液,沉淀用30 mL预冷的磷酸缓冲液充分悬浮后,再用30 mL预冷的磷酸缓冲液冲洗离心管并过滤,合并滤液得肌原纤维蛋白悬浮液。将蛋白质浓度稀释至0.5 mg/mL,并在540 nm下通过分光光度法测吸光度。MFI的计算方法是将读数乘以150。

1.2.6 游离氨基酸的测定 参照常亚楠等[11]的方法略作修改,称取一定量的待测样品,用绞肉机绞碎并称取5.0 g样品,置于离心管中,加入去离子水30 mL,冰浴中于15000 r/min速率下匀浆3次(每次10 s,间隔10 s),加入20 mL 5%(v/v)三氯乙酸(TCA)水溶液,混合均匀,于4 ℃下放置12 h;以定性滤纸过滤,滤液先用4 mol/L KOH调pH至9.0,然后用去离子水定容至50 mL,取5 mL用0.45 μm滤膜过滤。上清液使用高效液相色谱进行检测,进样体积为20 μL。

离子交换色谱条件:Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm×5 μm);反应柱温度40 ℃;紫外检测器(VWD)检测波长为338 nm,脯氨酸以262 nm检测;流动相流速为1.0 mL/min;氨基酸含量以外标法定量。

洗脱程序:流动相A(pH=7.2):27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(500∶0.11∶2.5),流动相B(pH=7.2):80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(1∶2∶2),流动相流速:1.0 mL/min;检测器:紫外检测器(VWD),检测波长为338 nm,其中脯氨酸的检测波长为262 nm。

1.2.7 扫描电子显微镜样品的制备和观察 将样品用液氮冷冻固定,用手术刀将样品切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉粒,用2.5%戊二醛(由体积分数25%戊二醛溶液与0.1 mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液按照1∶9 (V/V)混合)于4 ℃冰箱中固定12 h;漂洗:用pH6.8的磷酸缓冲液漂洗三次,每次15 min;锇酸固定:在含1.0%四氧化锇的磷酸缓冲液(pH6.8)中后固定2 h;再次漂洗:用0.1 mol pH6.8的磷酸缓冲液漂洗三次,每次10 min;脱水:分别用浓度为30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇进行脱水,每次15 min,100%乙醇脱水两次,每次15 min。脱完水以后用镊子将样品取出。粘样:将样品撕面作为观察面,观察面向上,用导电胶带粘在扫描电镜样品台上;镀膜:用离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层15 nm厚的金属膜;在扫描电镜下观察并拍照(加速电压为5.00 kV)。

1.3 数据分析

试验指标进行3次重复,结果以平均值±标准偏差表示。试验数据采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析,均值之间采用Duncan新复极差法进行多重比较,在0.05水平上进行显著检验(P<0.05),并使用SigmaPlot 10.0作图。

2 结果与分析

2.1 煮制时间对鹅肉蒸煮损失率的影响

肉在烹饪过程中因排出液体而发生重量的变化。这主要是由于热引起的蛋白质和脂肪的变化以及肉的结构变化[12]。从图1中可以看出,随着煮制时间的延长蒸煮损失率显著增加(P<0.05),且煮制120 min时的蒸煮损失率(39.0%)约为煮制0 min(27.5%)的1.5倍。

图1 煮制时间对鹅肉蒸煮损失率的影响Fig.1 Influence of cooking time on cooking loss rate of goose meat注:小写字母不同,表示差异显著(P<0.05)。

2.2 煮制时间对鹅肉剪切力的影响

嫩度是决定肉制品品质的重要因素之一,是对肉中各种蛋白质总体结构的概述[13]。剪切力法是测定肉类嫩度最古老的方法之一[14]。从图2中可以看出,从0～30 min剪切力显著升高(P<0.05)且在30 min时达到最高值53.9 N。从30～60 min处剪切力呈现下降(P<0.05),于90 min处出现最低值34.0 N。其中,60与90 min处的剪切力差异不显著。90～120 min时剪切力又呈现显著上升趋势(P<0.05)。Ali等[15]认为肌纤维之间与肌纤维内部存储大量水分。在加热过程中,蒸煮损失率的升高寓意着水分的减少,从而影响了水分的分布,水分分布的差异会影响肉的嫩度[16]。

图2 煮制时间对鹅肉剪切力的影响Fig.2 Influence of cooking time on shear force of goose meat注:小写字母不同,表示差异显著(P<0.05)。

2.3 鹅肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图谱

肌原纤维蛋白由肌动蛋白、肌动球蛋白和肌球蛋白等组成,对肉制品的凝胶特性有重要影响[17]。250 kDa处蛋白条带颜色随煮制时间的延长而变浅;130 kDa处蛋白条带颜色随煮制时间的延长而变浅,到煮制120 min时,条带消失;100 kDa处蛋白条带颜色随煮制时间的延长而变浅;70 kDa处蛋白条带在煮制30 min时,颜色变深,然而随着煮制时间的延长则变现出变浅至消失;35 kDa处蛋白条带在煮制0 min时颜色浅,煮制60 min时出现明显的加深,90 min后条带开始变浅;35～55 kDa处条带宽而清晰,随着煮制时间的延长条带逐渐成变浅而细;10～15 kDa处条带随煮制时间延长颜色变深,可能是鹅肉在加热过程中蛋白质不断发生降解,导致小分子量蛋白、多肽增加[18]。

图3 煮制过程中鹅肉肌原纤维蛋白SDS-PAGE图Fig.3 SDS-PAGE of myofibrillar proteins in goose meat during cooking

2.4 鹅肉肌原纤维小片化指数的变化

MFI是反映肌肉细胞内肌原纤维及其细胞骨架蛋白完整性的指标之一,MFI值与肉的嫩度相关性较高[19]。如图4所示,鹅肉的MFI值随着煮制时间的延长呈增大的趋势,表明加热过程中鹅肉的肌纤维发生不同程度的断裂和溶出。0～60 min处呈现显著性上升的趋势(P<0.05),但60与90 min之间差异不显著,但到120 min又发生显著性上升(P<0.05)，其MFI值约为处理0 min时的2倍。这可能是由于加热处理破坏了肌原纤维的结构,加速了肌原纤维蛋白的降解,从而引起MFI的升高。

图4 鹅肉煮制过程中肌原纤维小片化指数的变化Fig.4 Changes of myofibril fragmentation index in goose meat cooking注:小写字母不同,表示差异显著(P<0.05)。

2.5 鹅肉游离氨基酸含量的变化

鹅肉煮制过程中游离氨基酸含量的变化,如表1所示,鹅肉中共检出三种呈味氨基酸。从总量看,苦味氨基酸的含量最多,甜味氨基酸含量次之,鲜味氨基酸含量最少。从种类上看,甜味氨基酸共检出5种,苦味氨基酸检出9种,鲜味氨基酸检出3种。煮制过程中,这三类氨基酸总含量总体表现为随煮制时间的延长而增加的趋势,而甲硫氨酸和半胱氨酸这两者的含量随煮制时间的延长而减少。

甜味氨基酸可以增加鹅肉的鲜味,对丰富鹅肉的滋味起到重要的作用。煮制120 min时甜味氨基酸的含量(108.32 mg/100 g)显著高于0 min时(43.72 mg/100 g)(P<0.05),其中丙氨酸(Ala)、脯氨酸(pro)和甘氨酸(gly)含量较多,分别为35.64、30.17和15.63 mg/100 g。鹅肉煮制120 min时(163.31 mg/100 g)苦味氨基酸的含量显著高于0 min(52.08 mg/100 g)(P<0.05),其中亮氨酸(leu)、络氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(phe)和缬氨酸(val)的含量超过20 mg/100 g,这5种游离氨基酸的检出量均显著增加(P<0.05)。鲜味氨基酸是红烧老鹅重要的呈鲜味物质,主要有天冬氨酸和谷氨酸。其中谷氨酸的含量最高,也是鹅肉检出的17种游离氨基酸中含量最高的,是鹅肉重要的呈鲜物质。半胱氨酸和甲硫氨酸属于含硫氨基酸,含硫氨基酸能参与美拉德反应对肉品肉香风味的形成具有重要作用[20]。

表1 鹅肉煮制过程中游离氨基酸含量的变化Table 1 Changes of free amino acid content in goose meat during cooking

图5 煮制过程中鹅肉微观结构的扫描电镜图Fig.5 SEM of the microstructure of goose meat during cooking注:A为放大500倍,B为放大2000倍;1：煮制0 min;2:煮制30 min;3:煮制60 min;4:煮制90 min;5:120 min。

游离氨基酸对熟肉制品风味和滋味起到重要作用[21],游离氨基酸可以作为前体物质与还原糖发生美拉德反应,是生成肉类风味的重要反应。加热时间对肉类的食用品质有很大影响,肉类会发生蛋白质变性、肌纤维收缩或胶原蛋白溶解[22]。随着加热时间的延长,蛋白质逐渐降解成多肽或游离氨基酸,因此降解产物中游离氨基酸的含量会增加。甲硫氨酸和半胱氨酸为含硫氨基酸,随加热时间的延长而减少,含硫氨基酸是形成肉香味的重要物质[23]。

2.6 鹅肉加热过程中微观结构的变化

由图5可知,煮制过程中,肌束排列规则性明显地发了变化,使肌纤维之间的空隙表现出先变大后减小到粘成一块。同时,肌纤维结构的完整性也发生了变化,肌束膜在煮制过程中发生了不同程度的变化。煮制0 min时肌纤维束结构完整、排列较为松散、肌束间界限分明且空隙较大、纹理清晰。煮制30 min时,鹅肉组织结构完整性遭到轻度破坏、肌纤维明显收缩。煮制60 min时,鹅肉肌纤维结构开始变得疏松、肌内膜开始破裂,肌束膜遭到破坏会导致肌肉组织完整性丧失,致密结构被破坏,肌纤维束间空隙变小,使肌肉保水性下降,导致水分更易渗出而带来严重的汁液流失。煮制90 min时,肌纤维排列更加混乱、肌束间隙进一步减小、肌纤维边界更加模糊并伴有明显的断裂等。煮制120 min时,蛋白进一步降解及凝胶化加剧,导致肌束膜被严重破坏,进而导致部分肌纤维束发生崩塌使它们相互黏成一块,肌肉横截面纹理也变得很不规则。据报道[24-25],随着烹饪温度的升高和时间的延长,结缔组织会发生严重的变性形成凝胶。这些变性凝胶和其他微粒物质填补了空隙,导致肌肉紧绷。QI和Benjakul等[26-27]也在文中也提到了类似的结论,高温加工会使肉的微观结构发生不可逆转的变化。

3 结论

本文研究了煮制时间对鹅肉蒸煮损失率、剪切力、游离氨基酸构成、蛋白电泳及微观结构的影响。本实验发现随着煮制时间的延长,蒸煮损失率逐渐增大,剪切力则呈现先上升后下降再上升的的趋势,蛋白质会降解成分子量更小的蛋白质、多肽或游离氨基酸。游离氨基酸对熟肉制品风味和滋味起到重要作用,随着煮制时间的延长,蛋白质逐渐降解成多肽或游离氨基酸,从总量看,苦味氨基酸的含量最多,甜味氨基酸含量次之,鲜味氨基酸含量最少。煮制过程中,这三类氨基酸总含量总体表现为随煮制时间的延长而增加的趋势。鲜味氨基酸是鹅肉中主要的呈鲜物质,甜味氨基酸能够进一步促进鲜味。在电镜图中,肌束排列规则性明显地发了变化,使肌纤维之间的空隙表现出先变大后减小到粘成一块。同时,肌纤维结构的完整性也发生了变化,肌束膜在煮制过程中发生了不同程度的变化。肌纤维束间空隙变小,使肌肉保水性下降,水分渗出从而带着更多的汁液流失。因此,鹅肉的煮制时间以90 min为宜。