胡 菲，谢晓华

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是一个由蛋白质、多糖和水组成的复杂网络，指导细胞命运并影响组织发育和稳态，其组成和结构的扰乱会破坏组织发育和稳态，并促进疾病的发生[1]。BMP1/TLD样金属蛋白酶(BMP1/tolloid-like proteinase family，BTP)属于虾红素家族的成员，是细胞外基质金属蛋白酶小家族[2-3]。在哺乳动物中有4种BTP，包括骨形态发生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP1)、哺乳动物 tolloid(mammalian tolloid，mTLD)、哺乳动物tolloid 样 1(mTLL1)和哺乳动物tolloid 样 2(mammalian tolloid-like 2，mTLL2)[4]。BTP通过加工一些细胞外基质蛋白对一些组织器官发育起调控作用。众多研究表明，BMP1和mTLL1在牙齿发育中发挥重要作用。这两个蛋白酶在切割和激活分泌到前期牙本质-牙本质复合体和牙周膜的ECM蛋白方面具有共同功能[5]。本文就BMP1和mTLL1的结构、功能及其在牙齿发育中的研究现状作一介绍。

1 BMP1和mTLL1的结构及分布

1.1 BMP1和mTLL1的结构

BMP1最初是在能够异位诱导成骨的骨提取物中鉴定的，然而，与在这些提取物中发现的其他骨形态发生蛋白不同的是，BMP1不是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员，而是一种锌依赖性的金属蛋白酶[6]。Bmp1位于8号染色体上(8p21.3)[7]。mTLD是由Bmp1编码的更长剪接变体，此外，还有两种在遗传上不同的哺乳动物BTP：mTLL1和mTLL2，分别由Tll1和Tll2编码[3]。Tll1位于4号染色体上(4q32.3)[8]。

BMP1和mTLL1具有相似的蛋白质结构域结构，其中BMP1蛋白酶结构包括氨基末端前结构域、ASTIN样的金属蛋白酶结构域以及羧基末端的3个“complement-uegf-BMP1”(CUB)结构域和一个表皮生长因子(epitheloid growth factor，EGF)样的结构域，与BMP1不同的是，mTLL1具有5个CUB结构域和2个EGF结构域[3，9]。

1.2 BMP1和mTLL1的分布

BMP1和mTLL1在牙和骨骼等多种组织中共表达[10]。Bmp1在小鼠成牙本质细胞、牙周膜细胞和牙槽骨表面的成骨细胞中高表达，同时也在牙髓细胞中表达；在猪牙蕾的成牙本质细胞和前期牙本质中表达[5，11]。Tll1在小鼠成牙本质细胞、牙周膜细胞、牙槽骨表面的成骨细胞中表达，但表达水平低于Bmp1[5]。上述表明Bmp1在牙本质和牙周膜的形成中可能比Tll1发挥更重要的作用。在小鼠成牙本质细胞和牙周膜细胞、人的修复性牙本质和成牙本质细胞以及猪牙髓-前期牙本质-牙本质复合物中检测到BMP1蛋白；在小鼠成牙本质细胞中检测到mTLL1蛋白[5，11-12]。

2 BMP1和mTLL1的功能

BMP1和mTLL1由两个不同的基因编码，但同属于一个结构相似、功能重叠的细胞外基质金属蛋白酶小家族(BTP)[3]。体外研究表明，该蛋白酶家族的4个成员在切割和激活细胞外基质蛋白方面具有重叠活性[13-14]。

许多蛋白先以前体形式表达，然后经过蛋白酶的加工转变成有生物活性的蛋白质[15]。BTP作为金属蛋白酶参与此加工过程，主要作用是裂解并激活许多细胞外基质蛋白，在调节ECM形成中起重要作用[3]。这些蛋白包括胶原蛋白、富含亮氨酸的小蛋白聚糖、整合素小配体N-连接糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein，SIBLINGs)、赖氨酰氧化酶、脯氨酰氧化酶、基膜成分、潜在的TGF-β结合蛋白[4，6]。其中SIBLINGs在牙本质中表达，并具有调控牙本质形成的作用，其5个家系成员包括骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、基质细胞外磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoprotein，MEPE)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)和牙本质涎磷酸蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)[16]。另外据报道，BTP还能够激活TGF-β1，从而促进ECM的合成[6]。

最新研究结果显示Bmp1和Tll1敲除后，心血管组织中还存在尚未确定的代偿机制[17]，BMP1和mTLL1通过使胶质球蛋白失活作为一种额外的调节机制来确保周围神经系统(peripheral nervous system，PNS)朗飞结正确的时空组装[18]。

3 BMP1和mTLL1在牙体组织发育中的作用

3.1 BMP1和mTLL1促进牙本质的形成和矿化

牙本质发育不全(dentinogenesis imperfecta，DGI)是一种常染色体显性遗传疾病，其特征是牙本质矿化不良和牙本质结构改变[19-20]。Syx等[21]报道的4个BMP1突变的患者中有2个表现出典型的DGI症状：半透明和脆弱的牙齿，伴有棕色和乳光色，支持BMP1在牙本质形成和矿化中起重要作用的观点。

Wang等[22]通过他莫昔芬诱导组织中普遍存在的Cre表达使Bmp1和Tll1在小鼠出生后同时被敲除，结果显示该小鼠牙本质变薄和矿化缺陷、前期牙本质层扩大、牙根变短以及牙齿萌出延迟，其中磨牙牙根矿化率的降低程度比牙冠更为严重。另外Zhang等[5]通过构建Col1a1-Cre;Bmp1flox/flox;Tll1flox/flox小鼠模型(dcKO小鼠)，使表达Ⅰ型胶原蛋白细胞中的Bmp1和Tll1均失活，导致dcKO小鼠下颌第一磨牙牙根变短、牙本质变薄、牙髓腔增大以及牙本质小管排列紊乱且数量少于正常小鼠。综上所述，BMP1和mTLL1的活性对于牙本质(尤其是根部牙本质)的形成和矿化至关重要。

3.2 BMP1和mTLL1影响牙体组织发育的机制

牙本质细胞外基质由90%的Ⅰ型胶原和10%的非胶原蛋白组成，其中非胶原蛋白DMP1和DSPP在调控成牙本质细胞分化和牙本质基质形成矿化中起重要作用[23-24]。多项研究表明，BTP裂解并激活Ⅰ型胶原蛋白、DMP1和DSPP[4，13，25]。由此可见，BTP对于牙本质形成矿化的重要性。

为阐明BMP1和mTLL1在牙本质形成及矿化中的作用机制，Wang等[22]进一步研究。其组织学分析显示，BMP1和mTLL1广泛缺失小鼠的牙髓细胞增殖减少且成牙本质细胞分化减少以及极化缺失；分子机制研究表明，胶原蛋白在牙本质中蓄积，非胶原蛋白DMP1和DSPP急剧减少。Wang等[22]认为BMP1和mTLL1蛋白酶的缺失破坏了牙本质ECM正常形成矿化所需的胶原和非胶原蛋白水平的动态平衡，导致了胶原的异常堆积，并且积累的、经过异常加工的胶原蛋白可能会干扰非胶原蛋白DMP1和DSPP水平的稳态，从而出现了DGI样表型。Zhang等[5]机制研究也显示，dcKO小鼠牙本质中成牙本质细胞分化受到抑制，DMP1和DSPP的水平大大降低。此外，Dmp1-null[26]和Dspp-null小鼠都表现出相似的DGI样表型，说明这两种蛋白在牙本质形成矿化中起关键作用[27-28]。上述数据支持BMP1和mTLL1在控制牙本质的形成矿化及ECM胶原和非胶原蛋白稳态中起重要作用。

Zhang等[5]研究分析表明，与正常小鼠相比，Ⅰ型胶原蛋白表达细胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠前期牙本质层更宽，前期牙本质层中双链多糖(biglycan)的总体水平明显更高，磨牙牙本质中牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)减少。DSP是DSPP的N端片段，是前期牙本质-牙本质复合物中最丰富的非胶原蛋白[5]。以往研究表明，DSPP的蛋白水解过程对于形成健康的牙本质至关重要[29]。因此，推测dcKO小鼠的牙本质或前期牙本质中Ⅰ型胶原蛋白的切割失败导致这些小鼠的牙齿缺陷，并且未能裂解DSPP也可能是造成dcKO小鼠牙本质缺陷的另一个主要因素[5]。Steiglitz等[13]研究发现在Bmp1/Tll1-null小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)培养中，DMP1的加工受到影响，这项研究表明BMP1和mTLL1在矿化组织形成中的进一步作用是通过DMP1的蛋白水解作用实现的。综上所述BMP1和mTLL1通过水解加工DSPP和DMP1这两种蛋白质，从而对牙本质形成及矿化起促进作用。

此外，一项关于猪牙本质的研究表明，包括BMP1在内的astacin蛋白酶裂解DSPP，并生成牙本质唾液蛋白-牙本质糖蛋白(dentin sialoprotein-dentin glycoprotein，DSP-DGP)复合物和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)[11]。另外，Yamakoshi等[30]发现从DSPP嵌合体中释放DPP的起始裂解位点周围的氨基酸(在Gly472和Asp473之间)与BMP1的靶位点序列相匹配，并设计了含有Gly472-Asp473的荧光共振能量转移(FRET)-DSPP肽，发现重组的人BMP1催化的FRET-DSPP肽正是在该DPP裂解位点裂解。Ritchie等[14]研究也证明了BMP1可以准确处理杆状病毒表达的DSP-PP240，产生稳定的PP240和DSP430。由此可见，BMP1参与加工水解DSPP。Muromachi等[12]研究结果表明，BMP1的作用不仅限于作为催化酶加工牙本质特异性底物，还依赖于人类牙髓细胞中的细胞内在化作用来加速CCN2 / CTGF的产生从而参与骨样修复性牙本质的形成，阐明了BMP1的一种新特性：增强骨样修复性牙本质的形成。

4 BMP1和mTLL1在牙周组织发育中的作用

4.1 BMP1和mTLL1维持牙周稳态

有学者通过构建Bmp1和Tll1广泛性敲除小鼠模型，结果显示该小鼠牙周缺损进行性发展，表现为畸形的牙周膜(periodontal ligament，PDL)(不规则的PDL纤维)、牙槽骨量显著减少、牙骨质减少并矿化不良(细胞牙骨质急剧减少，无细胞牙骨质附着功能出现病理变化)以及牙周破坏加速[31]。此外，Zhang等[5]构建了Ⅰ型胶原蛋白表达细胞中Bmp1和Tll1失活小鼠模型，结果显示该小鼠牙槽骨缺失，PDL中的胶原纤维比对照组的小鼠厚，但并没有发展成牙周袋。以上结果均表明，BMP1和mTLL1在维持牙周稳态中起重要作用。为了进一步探究BMP1和mTLL1在维持牙周稳态中的单独作用，Wang等[32]将单Bmp1广泛性敲除小鼠和单Tll1广泛性敲除小鼠与双敲除小鼠进行对比分析，单Bmp1广泛性敲除小鼠与双敲除小鼠均表现出严重的牙周缺损，其特征是PDL纤维丢失、扩大的PDL区域中异位骨化以及牙槽骨和牙骨质体积急剧减少，而单Tll1广泛性敲除小鼠表现出非常轻微的表型，该结果表明在维持牙周稳态中BMP1比mTLL1发挥更重要的作用。

4.2 BMP1和mTLL1影响牙周组织发育的机制

为进一步研究其机制，Wang等[31]研究表明，BMP1和mTLL1广泛缺失会导致PDL和牙槽骨中DMP1(成熟骨细胞的关键标志物)水平显著降低，成骨细胞标志物骨唾液蛋白(BSP)和骨桥蛋白(OPN)的水平显著增加，成骨细胞分化缺陷；基质金属蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP13)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)表达显著增加，破骨细胞明显增加，而骨细胞和牙骨质细胞减少；与ECM结构缺陷相关的前胶原Ⅰ(Ⅰ型胶原的前体分子)的生物合成过程降低，从而未切割的前胶原Ⅰ显著增加；骨膜蛋白(PDL功能必需的基质蛋白)的水平变化与正常小鼠相似，表明该蛋白的缺陷不会导致异常PDL表型；最后，还证明了抗生素的全身应用显著改善了牙槽骨和PDL损伤，因此显示它们是病原体引起炎症的部分继发性疾病。以往研究也表明DMP1基因的缺失会导致PDL、牙槽骨和牙骨质缺损，从而增加对细菌感染的易感性[33]。以上发现表明BMP1和mTLL1通过提供成熟的胶原蛋白Ⅰ和有活性的DMP1来维持牙周基质的稳态；未切割的前胶原Ⅰ的积累、缺乏成熟的胶原蛋白Ⅰ以及活性DMP1的减少都会导致严重的牙周缺损，牙周缺损引起的炎症可能导致更严重的牙周破坏[31]。同时，Wang等[32]研究发现单Bmp1 广泛性敲除小鼠与Bmp1和Tll1双敲除小鼠牙周组织中成熟的Ⅰ型胶原蛋白大大减少、未切割的前胶原Ⅰ积累以及BSP、OPN、TRAP阳性细胞水平增加，而单Tll1广泛性敲除小鼠的变化相较更为温和。因此，Wang等[32]认为BMP1，而不是mTLL1，在通过加工胶原蛋白前体来维持牙周稳态中起着主导作用。

Zhang等[5]研究表明Ⅰ型胶原蛋白表达细胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠PDL的胶原纤维比正常小鼠厚，这表明BMP1和mTLL1的双重缺失可能改变了PDL的胶原结构。PDL中的主要胶原纤维是Ⅰ型胶原，并且以往研究表明BMP1和mTLL1充当前胶原Ⅰ的蛋白酶[4，34]。可推测dcKO小鼠中BMP1和mTLL1的缺失导致前胶原Ⅰ水解加工不良，而前胶原Ⅰ加工失败可能是导致组装异常、胶原纤维紊乱和增厚的主要因素之一[5]。 Syx等[21]透射电镜分析也显示，与BMP1基因突变相关的成骨不全症患者的皮肤具有不规则的Ⅰ型胶原纤维，纤丝直径可改变，并且某些纤丝比正常对照更厚。这与Ⅰ型胶原蛋白表达细胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠表现相似。

虽然Ⅰ型胶原蛋白是PDL的最主要成分，对组织至关重要，但众所周知其他ECM分子，如骨膜蛋白和原纤蛋白-1等在健康PDL的形成和维持中也起着重要作用[35-36]。骨膜蛋白和原纤蛋白-1是PDL中的两种ECM蛋白，其水平变化通常与PDL缺陷有关，Zhang等[5]研究表明，使小鼠Ⅰ型胶原蛋白表达细胞中Bmp1和Tll1失活，均可导致小鼠的PDL中原纤蛋白-1水平明显降低，而骨膜蛋白的水平与正常小鼠相似。 由于原纤蛋白-1的失活与人类的牙周疾病有关[37]，Zhang等[5]认为原纤蛋白-1的水平降低可能是导致PDL结构异常的原因，但是目前对原纤蛋白-1的急剧减少与dcKO小鼠的PDL中BMP1 / tolloid样蛋白酶的丢失之间的关系尚无明确的说法。

5 小 结

综上所述，BMP1和mTLL1作为细胞外基质金属蛋白酶，在切割和激活细胞外基质蛋白中发挥重要作用，促进成牙本质细胞和成骨细胞的分化，维持ECM中胶原和非胶原蛋白的稳态，在牙齿发育中发挥重要作用。但目前牙齿发育的分子机制尚不十分明确，仍有许多问题待解决，如其他ECM蛋白加工缺陷与牙齿发育异常的关系以及牙齿发育过程中复杂的信号交换等。未来在进一步研究的同时，也应将人类牙齿发育缺陷与动物模型相似的表型联系起来，以便更好地了解这些疾病的病因，为临床治疗提供新思路。