于晶晶，孟 颖，叶金海

唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是一种临床常见的唾液腺恶性肿瘤，每年报道的发病率为3.0/100万～4.5/100万例，约占头颈部恶性肿瘤的1%，约占唾液腺肿瘤的10%。除了最常累及小唾液腺(minor salivary glands,MSGs)外，还可累及大唾液腺(包括腮腺、下颌下腺和舌下唾液腺)，少数甚至会累及耵聍腺、泪腺等头颈部其他部位[1]。与其他恶性肿瘤相比，SACC往往生长缓慢，具有高度嗜神经特性，侵袭性强并易入侵血管，导致血行转移。肿瘤细胞如侵袭进入神经束膜，则单纯手术并不能完全切除干净。唾液腺样囊性瘤远期预后不良，文献报道后5年生存率为89.0%，10年生存率为67.0%，15年生存率为39.6%[2]。对其治疗方法包括手术治疗、放化疗、生物治疗等[3]。近年来，对该病的发病机制和分子表型的研究取得了一些进展[4]，细胞的划痕实验、增殖实验和侵袭实验等体外实验方法的运用，使研究人员逐渐认识到外泌体在实体肿瘤的增殖、迁移和侵袭中起重要作用，进一步探究关于外泌体在腺样囊性癌中的功能具有重要意义，可为腺样囊性癌的发病机制研究开拓新思路。本文就外泌体在SACC中的功能研究进展作一综述，从而为临床治疗SACC提供新的理论基础。

1 外泌体(exosomes)

外泌体(exosomes)最初由Johnstone等于1985年从绵羊网织红细胞上清液中分离而得[5]。外泌体的直径在40～100 nm，这种囊泡广泛分布在体液中[6-7]，可由多种类型的细胞分泌并释放到细胞外间隙。最初外泌体的特性未被揭露，后随着研究的深入，发现这种双层膜性囊泡由多种成分组成，包括蛋白质、多糖、脂质、各种代谢物、RNA和DNA等[8]。外泌体常用的纯化和检测方法包括超速离心技术、蔗糖密度梯度离心法、聚乙二醇(ployethyleneglycol，PEG)沉淀法、超滤分离法、免疫亲和捕获方法[9]。每项技术都具备各自明显的优缺点，故应根据实际实验需要选取适当的方法进行外泌体的分离。通过透射电镜、蛋白免疫印迹实验以及纳米粒子追踪分析仪(nanoparticle tracking analysis, NTA)粒径分析实验联合证明用上述方法从体液和细胞上清中分离出来的物质是外泌体。外泌体是细胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的一种亚型[10]，经核内体途径形成，是由早期核内体的向内出芽形成的。其通过胞吐作用分泌到胞外，作用于相应的靶细胞并产生一系列生理和病理作用。外泌体参与基本的生理过程，如神经元通信[11]、抗原递呈[12]、免疫应答[13]、器官发育[14]和生殖性能[15]。它们还参与了一些病理过程，包括癌症进展[16]、炎症[17]、心血管疾病[18]等。同时外泌体可携带功能性分子作为关键致病蛋白，与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病有关[19]。

2 外泌体对肿瘤的调控

外泌体参与许多机体的生理和病理过程，其中外泌体在肿瘤进展方面产生的作用受到广泛关注。外泌体对肿瘤调控所起的作用是双向的，即不同类型的外泌体起到促进或抑制肿瘤的作用：大多数免疫细胞来源的外泌体通过对相应特定靶细胞的作用抑制肿瘤生长；而肿瘤细胞来源的外泌体(TEXs)则通过不同的机制促进肿瘤的侵袭、转移、远处转移等恶性生物学行为。外泌体与肿瘤的双向关系中后者的研究受到相对多的关注，在肿瘤的发生发展、诊疗及耐药性中具有重要的研究价值和临床意义。外泌体参与许多肿瘤的发生发展过程，如骨肿瘤、B细胞恶性肿瘤、黑色素瘤、白血病、肺癌、唾液腺样囊性癌、消化道肿瘤。此外，外泌体在一些非肿瘤疾病中的作用也受到越来越多的关注。尿液外泌体是一种肾脏疾病的新型生物学标志，在一些非肿瘤性肝脏疾病中外泌体也扮演着重要的角色，可作为肝脏疾病诊断和预后的潜在标志，也可作为载体在细胞间传递药物和靶向基因。

3 外泌体参与肿瘤进展

外泌体中富含的肿瘤相关蛋白、核酸(包括miRNAs、lncRNAs、circRNAs、mRNAs、DNA)以及糖蛋白、糖脂等糖复合物和脂质，是肿瘤诊断的重要特异性标志物。随着外泌体分子生物学特性和相关结构功能研究的深入，其在肿瘤患者的血液或者其他体液中开展“液体活检”，这一独特功能也逐渐揭露并得到越来越多的认可。外泌体在肿瘤微环境中起到改变肿瘤转移前微环境、参与血管形成、促进肿瘤转移、影响免疫系统调节的作用，对肿瘤的发生发展起到重要作用。Jang等研究显示，在小鼠乳腺癌4T1细胞系中，其来源的外泌体具有促癌作用，肿瘤来源的外泌体具有影响巨噬细胞浸润和M2极化的作用，从而影响肿瘤的发生发展[20]。Grange等研究发现，外泌体促进血管形成和肿瘤转移微环境的形成，尤其是促进CD105+肾细胞癌发生肺部的远处转移。miRNA、mRNA、蛋白质等作为重要的信号分子由外泌体运输、传递给肿瘤微环境中的受体细胞，改变其正常生理或者病理过程，从而发挥重要的作用[21]。Zeng等研究发现，结直肠肿瘤来源的外泌体通过miR-25-3p靶向于Kruppel样转录因子2(KLF2)和KLF4，调控内皮细胞VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5的表达，增加血管通透性，促进血管生成，同时也促进了结直肠癌向肝和肺的远处转移[22]。Lee等研究发现，卵巢癌中OVCAR-3 EOC细胞螯合作用触发的外泌体(chelation-induced exosomes，CI-exosome)由细胞外钙离子的螯合作用诱发产生并释放到细胞外间质，不同来源和不同类型的外泌体亚类调控着肿瘤细胞各异的生物学行为[23]。

4 外泌体在唾液腺样囊性癌中的作用

外泌体在肿瘤发生发展过程中对肿瘤作用的调控是双向的。一方面，以自然杀伤(NK)细胞为代表的大多数免疫细胞来源的外泌体通过激活或杀伤靶细胞的能力对转移性或血液病恶性肿瘤显示出快速的免疫力，并且临床上表现出一定的抗肿瘤能力[24]。另一方面，肿瘤来源的外泌体通过miRNA与肿瘤微环境中的间质细胞相互作用，调节肿瘤进展、血管生成、转移和免疫逃逸[25]。这里着重于SACC细胞衍生的外泌体(TEXs)在SACC中作用的研究进展，探索SACC来源外泌体在疾病进展中的作用机制，并在一定程度上提示其潜在应用于临床肿瘤治疗的意义。

4.1 促进肿瘤增殖

正常细胞增殖与凋亡的平衡维持着体内组织器官的生长代谢平衡，而肿瘤细胞中细胞增殖与凋亡的失衡主要表现在肿瘤细胞毫无约束地增长以及凋亡作用的减弱，最终导致肿瘤快速发展。肿瘤细胞来源的外泌体可促进唾液腺腺样囊性癌的增殖。Liu等研究表明，通过PKH67绿色荧光标记法发现SACC-83可以摄取自身来源的外泌体，这表明SACC-83为自身来源外泌体的靶细胞，也意味着腺样囊性癌细胞可通过外泌体途径将促瘤因子传递给自身，改变自身基因表型，从而影响肿瘤细胞的生物学功能[26]；此外，MTT细胞增殖实验证明了SACC-83来源的外泌体作用于SACC-83本身后其增殖能力显著增强，这提示了在SACC肿瘤进展过程中，自身来源的外泌体扮演着“促瘤因子”的作用，该实验进一步证实了外泌体促进肿瘤细胞增殖的作用是通过MAPK/ERK信号转导通路实现的，NDRG2(N-myc downstream-regulated gene 2)基因的下调与较低的SACC总体生存率和无远处转移的生存率有一定的关系；外泌体携带的miRNA与SACC肿瘤细胞的增殖和转移也有关联，这提示miRNA可能作为NDRG2基因的重要调控因子在SACC肿瘤细胞的增殖、转移等肿瘤进展中发挥不可忽视的作用[27]。马杰等研究发现，酪氨酸蛋白激酶阻断剂genistein(4′-5,7-三羟基异黄酮)对SACC-83细胞株具有显著的抑制效应，且该抑制效应具有剂量和时间依赖性，随着剂量和时间的增加而增加[28]，其机制可能为genistein阻断了细胞周期G2期向M期的转变，并且诱导细胞凋亡，这为利用外泌体装载genistein途径治疗SACC肿瘤细胞提供了新思路。

4.2 促进肿瘤嗜神经侵袭(PNI)

嗜神经侵袭(perineural invasion，PNI)特性是SACC显著的生物学特征之一，并且被认为是不利的预后因素。Amit等调查了1985年至2011年间在全球9个癌症中心接受过ACC治疗的所有患者，在239例(48%)神经侵犯患者中，有174例(73%)发生神经周侵犯，65例(27%)发生神经内侵犯，37例(15%)发生神经周围炎症(癌细胞浸润到神经周围间隙中，并伴有淋巴细胞浸润)[29]。郭佳等研究发现，施万细胞作为神经周围肿瘤微环境的一个关键因素，能通过NT-3/TrkC信号通路影响肿瘤微环境的变化，对SACC嗜神经侵袭(PNI)起到促进作用[30]，在NT-3的作用下，SACC细胞的TrkC特异性受体发生酪氨酸磷酸化，激活下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信号通路，提高SACC的侵袭能力。这一过程中神经营养因子家族的可溶性小分子蛋白NT-3作为外泌体可能携带的物质促进肿瘤的嗜神经侵袭，且肿瘤和神经周围的微环境有助于施万细胞早期主动向肿瘤细胞的迁移[31-32]。最近对ACC中神经周侵袭的存在进行系统评价表明，它与远处转移或生存率无关，但与局部复发和切缘累及有关[33]，这一特征影响患者的治疗及预后。对患者进行长期随访，随访过程中监测肿瘤的临床表现，对于更好地了解ACC并进行进一步临床病理评估，以及改善预后至关重要。

4.3 促血管生成作用

血管生成对于实体肿瘤生长和远处转移至关重要[34]，SACC也不例外。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是极为重要的血管生成介质因子[35-36]。血管生成的关键是促血管生成细胞因子的VEGF家族与其各自受体的相互作用，其中VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盘生长因子(PIGF)，VEGF受体家族包含VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。其中VEGFR2的表达通常仅限于血管内皮细胞，被广泛认为是驱动血管生成的主要受体[37]。刘佳等研究发现，一些基因和蛋白通过调节VEGF的水平来调节SACC的侵袭和转移[38]，这些基因包括抑癌基因P53、PTEN、融合基因MYB-NFIB；蛋白包括缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha, HIF-1α)、癌胚抗原相关粘附因子-1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1, CEACAM-1)、整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、DNA结合分化抑制蛋白(inhibitor of DNA-1, Id-1)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、STAT3(信号转导与转录激活因子3)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、CD147(EMMPRIN)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)。这些蛋白因子和基因之间也存在相互作用，共同调节VEGF水平。

4.4 远处转移

SACC患者肿瘤的远处转移频繁发生，主要发生在治疗后的前5年。研究表明远处转移发生率为20%～52%，平均时间31.50～46.00个月[39]。而远处转移是导致大多数癌症患者死亡的主要原因。Syn等研究发现，外泌体是肿瘤细胞与肿瘤细胞间或肿瘤细胞与间质细胞间通信且关键的信使，细胞间借助外泌体来构建局部和远距离的微环境[40]。肿瘤来源的外泌体(TDE)可能通过上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、形成转移前肿瘤微生态以及通过免疫调节作用，促进肿瘤逃脱免疫监测等机制，以促进肿瘤增殖和扩散而发生远处转移的开始。鉴于TDE在SACC远处转移中的重要作用，针对TDE的策略对于改善癌症患者的结局至关重要。一些使用基于RNA的敲除策略提供了TDE抗肿瘤转移作用的概念，可以设想利用外泌体的组织特异性将这类治疗性核酸药物输送至肿瘤细胞内治疗的临床应用[41]。Ni等研究发现，SACC的血源性转移与NRP1和VEGF-A的高表达以及Sema-3A和Sema-3F的低表达有关[42]。此外，该研究还发现，由于NRP1和VEGF-A结合而引起的肿瘤组织中微血管数量增加，是导致SACC中血源性转移常见的原因之一。

SACC肿瘤远处转移最常见于肺，其次是骨骼、肝和脑，一些患者会涉及多个部位的肿瘤转移[43]，由于其早期症状不明显，因此在初次就诊时容易遗漏血源性转移病灶存在的可能。Zhang等研究发现，与SACC-2(低肺转移细胞系)和SACC-83(低肺转移细胞系)细胞相比，SACC-M(高肺转移细胞系)细胞中大多数硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)的表达均降低，但磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(Glypican-5,GPC5)表达在SACC-M中分别提高了3.24倍和815.69倍(超过3倍)[44]，HSPG和GPC5可由囊泡包裹至外泌体分泌到细胞外间质。免疫组织化学分析显示，与无肺转移的SACC相比，有肺转移的SACC中GPC5的表达更高。 尽管GPC5沉默对SACC-M细胞增殖没有显著影响，但GPC5沉默后，裸鼠SACC-M细胞的肺转移明显减少(P<0.05)。这些均提示GPC5可能有助于SACC的肺转移。Kong等[45]研究发现，癌相关的成纤维细胞(CAF)分泌的EVs在小鼠中诱导了肺转移前的生态位形成，因此增加了SACC肺转移。由CAF分泌的EV促进的肺成纤维细胞活化是肺转移前的生态位形成的关键事件。整联蛋白α2β1介导肺成纤维细胞摄取CAF分泌的EV，并被TCI-15阻断，从而阻止了肺转移前生态位的形成和随后转移的发生。携带异种移植物并具有高肺转移风险的小鼠血浆EV整合素β1明显上调。这表明血浆EV整合素β1可能是早期预测SACC转移发生的有前途的生物标志物。

ACC患者长期生存率低与发生远处转移直接相关，针对肿瘤和间质细胞的综合策略对于预防SACC转移是必要的。针对HSPG、GPC5、CAF EV、血浆EV整合素β1等这些肿瘤来源外泌体的监测有望成为进行早期SACC诊断方面可能是有前途的有效候选靶标。

5 结 语

综上所述，外泌体与SACC发生发展密切相关是明确的。外泌体在多种病理生理过程中发挥重要的作用，尤其是在SACC的疾病进展中，外泌体促进了肿瘤的增殖、嗜神经侵袭、促血管生成作用以及远处转移和肺转移。但是，目前大规模使用外泌体作为治疗工具面临着实际的挑战。因为几微克的外泌体就需要数十亿个间充质干细胞(MSC)的培养，目前还没有标准的、有效的方法进行外泌体的大规模生产和纯化；而且外泌体的治疗剂量和治疗效果有待进一步研究，仍需要大量基于支持科学和转化数据的临床试验以便推动外泌体治疗的进展。