周红艳，张晓旻，曹 灵，王 珏，梅予锋

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

Estiseal F光固化窝沟封闭剂、35%GLUMA釉质酸蚀凝胶(Heraeus，德国)；37 ℃恒温培养箱(精宏，中国上海)；4 ℃冰箱(海尔，中国山东)；抗酸指甲油(Maybelline，美国)；低速切割机(Isomet 1000，美国)；体视显微镜XTB-1型(江南光学仪器厂)；低速杯状刷(TPC，美国)；高速1/2球钻(FG1/2，DENSPLY，美国)；原子力显微镜(Veeco，Autopbobe CP-R型，美国)。

1.2 方法

1.2.1 标本选择 2017年7月—10月在南京医科大学附属口腔医院颌面外科收集50颗因阻生拔除的下颌第三磨牙。纳入标准：牙体完整，无龋坏，无磨耗，无隐裂，无染色，无釉质发育不良，深窝沟明显。4 ℃生理盐水浸泡保存。深窝沟的标准为:肉眼观察离体牙，看不到窝沟底部，可以插入或卡住探针[4]。

1.2.2 样本分组与操作方法 将50 颗离体牙随机编号分组，每组10颗，共5组。使用1/2球钻对窝沟进行釉质成形[5]，35%磷酸酸蚀30 s，冲洗后干燥，涂封闭剂，组1即刻光照40 s 使其固化。组2、3、4、5组标本分别停留15 s、30 s、45 s、60 s后光固化40 s。

窝沟封闭完成后要求所有深窝沟均被窝沟封闭剂覆盖，并探诊光滑，无气泡。然后将样本浸泡于37 ℃生理盐水中24 h，分别浸入5 ℃和55 ℃蒸馏水中进行500个温度循环，每个温度停留30 s。用浸蜡法包裹整个牙根，对距封闭剂边缘1.0 mm外的牙冠涂布3层指甲油，待指甲油干燥后，将样本浸泡于37 ℃ 1%的亚甲基蓝溶液中24 h后取出，流水冲洗24 h，于4 ℃蒸馏水中储存。截除牙根，用蜡块固定牙冠，用低速切割机沿近远中[6]窝沟片切标本，每个样本得到2个切片，共100个切片。

1.2.3 渗透率和微渗漏测定 分别由两位检查者在带测微器目镜的体视显微镜( ×30)下，对每个切片进行检测，Kappa 值为0.87。测量方法参考Bahar法[7]。测量并记录切片中最深窝沟内封闭剂渗透深度的网格数(e)、窝沟深度的网格数(e+f)及染料渗漏的网格数(a+c)、封闭剂与窝沟交界面的网格数(b+d)[8](图1)。封闭剂渗透率=e÷(e+f)×100%，微渗漏率=(a+c)÷(b+d)×100%。

图1 测量方法示意图Fig.1 Schematic diagram of measurement method

1周后，重复测定，每个切片经过2次评估共有4次测定值，记录其平均值。

1.2.4 原子力显微镜的超微结构观察 根据体视显微镜结果选取即刻组及30 s组切片固定于硬组织切片机上，平行切片，切成约1 mm厚硬币大小，彻底干燥保存。将样品固定在原子力显微镜XY扫描台上，用监视器定位样本的封闭剂-釉质交界面，在大气中进行扫描成像。仪器工作方式为轻敲式，MPP-11123-10硅探针，所用的微悬臂力常数为20～80 N/m， 扫描长度为5 μm。利用仪器自带的软件(Image Processing Software Version 2.1)进行图像数据的采集。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，使用K个独立样本非参数检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 渗透及微渗漏情况

窝沟封闭不同渗透时间组的渗透率与边缘微渗漏率见(表1)。随着渗透时间的增长，封闭剂的渗透率明显增加，在30 s时达到高峰，45 s及60 s时渗透率又平缓下降。K个独立样本非参数检验显示，5组的渗透率有统计学差异(P=0.031)，即刻固化组与30 s、45 s及60 s组均有显著差异(P<0.05)，其余各组之间无统计学差异(P>0.05)。而各组的边缘微渗漏率无统计学差异(P>0.05)。

表1 不同渗透时间组封闭剂的渗透率及微渗漏率 Tab.1 Penetration rates and microleakage rates of sealant in different groups

2.2 原子力显微镜观察结果

即刻组及停留30 s组的二维图像均显示明显的树脂突，清晰规则，三维图像显示树脂突密集排列，树脂突长度无显著差异。见图2、3。

3 讨 论

窝沟封闭作为预防窝沟龋的一种有效方法已被许多研究证实，并被临床广泛接受[9-11]。窝沟封闭通过保护牙釉质不受细菌及代谢产物的侵蚀，以及断绝原来存在于窝沟中细菌的营养来源这两种作用机制，有效预防乳、恒牙窝沟龋的发生[12]。

树脂类窝沟封闭剂是一种高分子材料，具有良好的流动性，可以渗入狭窄的窝沟底部[13]。理论上，流动时间延长， 窝沟封闭剂渗透的深度应增加。本研究结果表明光照之前停留渗透30 s可以使封闭剂的渗透深度及封闭剂与牙面之间的密合性达到最优化，渗透30 s以上封闭剂的渗透深度并没有继续明显增加，微渗漏率也并没有显著减少；相反，随着渗透时间的增加，其渗透深度的平均值略有降低，微渗漏率也略有升高，但是与渗透30 s组的实验结果并没有显著差异。

1987年Chosack等[14]研究了光照之前渗透时间分别为0.5 s、5.0 s、10.0 s及20.0 s的树脂突长度，结果发现渗透20.0 s可以使封闭剂形成的树脂突达到最长。Meyer-Lueckel等[15]在2006年研究了5种粘结剂及1种封闭剂分别在渗透15、30 s后渗透进牛牙釉质表面损害的能力，他们的研究结果显示渗透时间增加，其材料的渗透深度及均一性均显著增加。

A：二维图，显示明显的树脂突，清晰规则；B：三维图，显示树脂突密集排列，长度一致

A：二维图，显示树脂突明显清晰，排列规则均匀；B：三维图，显示树脂突长度一致，排列密集

窝沟封闭剂被特定波长的光源照射后，很快聚合固化，失去流动性。如果光照之前窝沟封闭剂有足够的时间来渗透，则其渗透深度可达到最大化，不会产生与牙面之间的缝隙，与牙面达到良好的密合性，即不会产生微渗漏。因为光固化树脂暴露于环境光线中较长时间时也会逐渐固化[16]。同理临床操作时，如果渗透时间延长，由于环境光源的影响，树脂类封闭剂表层也会缓慢固化，影响了封闭剂的流动，导致表层下的封闭剂固化不全或固化不均匀，使深窝沟最底处封闭不全且密合不良；同时临床操作时渗透时间延长，增加了唾液污染的风险，并不能产生理论上最大的渗透深度与最小的微渗漏。Hosseinipour、张晓晓等均研究证实唾液污染后窝沟封闭的微渗漏明显增加[17-18]。Gawali等[19]研究发现唾液污染后疏水性封闭剂材料渗透深度明显减少。

Chosack等[14]通过观察发现临床使用光固化封闭剂通常不超过5 s即光照，并且由于儿童配合程度的影响，几乎都是即刻光照。光固化封闭剂因易控制，操作时间短，缩短了对幼儿控制唾液污染的时间等优点在临床广受欢迎。临床中如果为了获得最佳的渗透深度而使渗透时间延长，同时又要防止唾液污染，则必须保证完全的隔湿与干燥。

原子力显微镜一般有3种工作模式:接触模式(contact mode)、非接触模式(non-contact mode)和敲击模式(tapping mode)[20]。3种模式各有特点，可根据样品性质及实验需求选择不同模式。其中敲击模式不仅减少了接触模式下扫描时针尖对样品表面的影响，又具有比非接触模式高的分辨率，适合树脂突超微结构研究，因此本研究选择了敲击模式。关于扫描电镜观察口腔科材料超微结构的文献很多，原子力显微镜在口腔研究中的应用逐渐广泛，Tuncay等[21]利用原子力显微镜研究树脂根管封闭剂表面硬度，Keinan等[22]用原子力显微镜观察牙釉质的形态结构，但是关于原子力显微镜观察封闭剂树脂突的实验较少，因此本实验尝试用原子力显微镜观察封闭剂树脂突的形成情况。

本实验结果提示，临床操作窝沟封闭中，光照之前使封闭剂有最佳的渗透时间，可以获得良好的边缘封闭性能，期待进一步研究证实，以望临床应用。