徐 凡，张艳美

(汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041)

线粒体是真核细胞的一类具有内外双层膜的亚细胞器[1]，作为细胞的“能量工厂”，细胞所需90%的能量来自线粒体的氧化磷酸化作用[2]。心肌缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、糖尿病和衰老等与线粒体的功能障碍有密切关系[3]。线粒体在心肌细胞中含量丰富，约占细胞容积的30%，常被分离出来作为单独的细胞器进行研究[4]。由于心肌组织结构致密，相对于其他组织，匀浆所需的机械强度较高。不当的组织匀浆方法往往造成线粒体结构与功能损伤，影响研究结果，因此选用合适的匀浆方法，既确保分离线粒体的纯度又保证其结构功能的完整性，有着至关重要的意义。本研究探讨研磨珠匀浆法、乳化分散仪法、玻璃匀浆器法三种不同的匀浆方法对分离小鼠心肌组织线粒体质量的影响，从而确定更优化的心肌组织线粒体分离方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物 C57BL/6JNifdc小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，雄性，8～12周龄，体重18～23 g，生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。实验所用的饲料，饮用水和垫料经过高压灭菌处理，饲养过程严格遵守实验动物的3R原则。小鼠随机分为研磨珠匀浆法组、乳化分散仪法组、玻璃匀浆器法组，每组3～5只。

1.1.2 主要材料、试剂与仪器 戊巴比妥钠(德国Merck公司)，组织线粒体提取试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(上海碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，COXⅣ单克隆抗体和GAPDH单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，HRP标记的山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，TS-48高速组织研磨机(上海净信实业发展有限公司)，IKA T10 basic ULTRA-TURRAX分散仪(德国艾卡公司)，1 mL玻璃匀浆器(江阴市精英玻璃制品厂)，Spectra Max M 2多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)，JEM1400透射电子显微镜(日本电子株式会社)，垂直电泳仪(美国Bio-RAD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌组织线粒体提取 小鼠禁食12 h后称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠，待小鼠麻醉后，用脱毛膏将胸部毛发除去，沿着腹部剪开，取出心脏，用生理盐水洗去残余的血液，用镊子剥去右心室组织，剩余组织放入提前预冷的离心管中，称重，加入10倍体积(10 mg组织加入100 μL试剂，下同)磷酸盐缓冲液，用小剪刀将组织剪碎，冰浴3 min。于台式冷冻离心机中4℃，600g离心30 s，弃上清，加入8倍体积的胰酶消化液，冰浴20 min，每5 min涡旋1次。4℃，600g离心30 s，弃上清。加入2倍体积线粒体分离试剂A，洗去残余的胰酶，600g离心30 s，弃上清，收集沉淀。加入8倍体积线粒体分离试剂A(提前加入苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制剂)。分别采用以下3种匀浆方式进行组织匀浆。(1)研磨珠匀浆法：将样品移至特制的2.0 mL研磨离心管，分别加入大小研磨珠各1粒，放置于高速组织研磨机的固定台上(固定台-30℃预冷)进行研磨。研磨条件为：60 Hz，匀浆30 s，重复4次；(2)乳化分散法：将样品移至2.0 mL离心管，冰浴中匀浆。IKA分散仪匀浆条件为：6档，匀浆5 s，重复4次，每次间隔10 s；(3)玻璃匀浆法：将样品移至玻璃匀浆器中，置于冰上，反复研磨30次。将3种匀浆方法得到的组织匀浆液移至2.0 mL离心管，于台式冷冻离心机中4℃，600g离心5 min。离心完毕将上清液移至2.0 mL离心管，4℃，11 000g离心10 min。将上清液移至新的2.0 mL离心管，沉淀即为分离的线粒体。将线粒体沉淀保存在线粒体储存液中，涡旋成混悬液，用于后续实验。若要获得无线粒体蛋白污染的细胞质蛋白，需要将分离得到的上清液，4℃，12 000g离心10 min，取上清。

1.2.2 Western Blot检测蛋白水平 采用Western Blot方法分别检测细胞质和线粒体裂解液中的细胞质内参蛋白(GAPDH)和线粒体内参蛋白(COXⅣ)的表达水平。将线粒体混悬液4℃离心10 min，12 000g，弃上清，加入线粒体裂解液，冰上静置裂解12 min，然后用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。随后进行电泳，转膜，牛奶封闭，抗体杂交(GAPDH 1∶1 000，二抗 1∶20 000，COX Ⅳ1∶3 000，二抗1∶40 000)，洗膜和显色。

1.2.3 酶标仪测定线粒体提取效率 酶标仪检测线粒体蛋白浓度。线粒体蛋白提取效率(ŋ)计算公式如下：

式中，c为线粒体蛋白浓度，V为线粒体蛋白体积，m为心肌组织质量。

1.2.4 透射电镜观察线粒体的超微结构 将线粒体混悬液4℃，12 000g离心10 min，弃上清，立即加入2.5%戊二醛固定，置于4℃冰箱，保存2 h。将样品用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次洗完用微波炉加热30 s，然后加入1%锇酸固定1 h。固定后用磷酸盐缓冲液洗3次，分别用50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇脱水，滤纸吸干乙醇；加入LR White包埋剂渗透2 h。加热聚合，超微切片，厚度60～80 nm。醋酸铀染色30 min，枸橼酸铅染色5 min，上机观察。

1.2.5 酶标仪检测线粒体膜电位 采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)检测线粒体膜电位。以红绿荧光的比值反映线粒体膜电位的强弱。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同的匀浆方法对心肌组织线粒体提取效率的影响

研磨珠匀浆法组，乳化分散仪法组和玻璃匀浆器法组线粒体提取效率分别为(8.30±1.68)μg/mg、(8.05±2.58)μg/mg和(8.48±2.01)μg/mg，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1 不同匀浆方法对心肌组织线粒体提取效率的影响

2.2 不同的匀浆方法对心肌组织线粒体纯度的影响

3种匀浆方式得到的心肌组织细胞质中GAPDH蛋白含量丰富，而线粒体裂解液中未见GAPDH的表达；提取的线粒体裂解液中COXⅣ蛋白含量丰富，而细胞质中该蛋白含量极低，见图2。

图2 心肌组织细胞质与线粒体提取液中GAPDH和COXⅣ蛋白的表达

2.3 不同的匀浆方法对心肌组织线粒体膜电位的影响

与研磨珠匀浆法组相比，乳化分散仪法组与玻璃匀浆器法组的线粒体膜电位明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与乳化分散仪法组相比，玻璃匀浆器法组线粒体膜电位明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 不同匀浆方式对心肌组织线粒体膜电位的影响

2.4 不同的匀浆方法对心肌组织线粒体超微结构的影响

研磨珠匀浆法组的线粒体结构完整，呈球状或短棒状，具有清晰的内外膜和嵴，基质均匀致密，未见细胞核、内质网等细胞器污染；乳化分散仪法组出现形态结构不完整的线粒体，如部分线粒体内外膜分离破裂，线粒体嵴紊乱，基质减少，甚至出现溶胀变大及空泡样变和破碎等现象；玻璃匀浆器法提取的线粒体大部分结构完整，部分线粒体内外膜分离或破碎，未见其他细胞器污染。见图4。

图4 不同匀浆方法对心肌组织线粒体超微结构影响(×8 000，局部放大部分×15 000)

3 讨论

线粒体除了为细胞供能，也参与了许多重要的生理病理过程，如细胞程序性死亡，钙稳态失衡以及氧化应激事件等。心脏作为全身的动力器官，需要保证充足的能量，心肌组织线粒体的重要性不言而喻，因此无论是病理机制的研究还是药物靶点探讨，都需单独将线粒体提取出来进行针对性地研究[5-6]。与其他组织不同，心肌组织结构致密，粗细肌丝排列有序，肌丝间线粒体呈球状或短棒状，呈晶格状排列，这也导致了心肌组织线粒体分离时不易保证结构和功能的完整性。目前，无论是心肌组织还是非心肌组织，线粒体的提取方法主要是差速离心法，在此基础上，学者们针对线粒体的分离提取液对提取线粒体的质量做过不少讨论[7-8]，商品化的线粒体分离试剂也被广泛应用，这对于提高线粒体的提取质量非常有益。但有个不容忽视的问题是，线粒体提取的前期过程中，组织的分离尤其是致密心肌组织的分离也决定着线粒体的提取质量。本研究充分借鉴了差速离心法这一传统线粒体分离方法，另外选用了常用的组织线粒体分离试剂盒，探讨研究中常采用的3种组织匀浆方式对于线粒体提取的效率和质量的影响，研究显示不同的匀浆方法对心肌组织线粒体的提取效率与纯度影响的差异不大，但对线粒体膜电位与超微结构有着不同程度的影响。

为了提取到更多的心肌组织蛋白或RNA等物质，往往需要采用机械功率大的仪器将组织充分匀浆，而功率大的仪器在破碎组织的同时，不可避免地导致线粒体等细胞器遭到破坏。因此，如以线粒体为单独的研究对象，无论是机械剪切，撞击撕裂还是挤压组织的方式，都需要保证分离线粒体结构与功能的完整。本研究中，研磨珠匀浆法有利于维持线粒体的功能与结构，最大限度地避免了因匀浆方法不当而导致线粒体膜电位的下降和超微结构的破坏。而乳化分散仪法的线粒体膜电位和形态结构都遭到了一定的破坏，甚至采用玻璃匀浆器这一手动方法所得线粒体的质量都略优于它，这充分说明心肌组织线粒体的提取过程中机械操作一定要柔和。IKA乳化分散仪的最高转速虽常用于心肌组织总蛋白或总RNA提取，但并不适用于心肌组织线粒体的提取。改用低转速是否会取得更好的结果有待于进一步研究。此外，本研究也提示，在实验条件不足的情况下，可考虑采用玻璃匀浆器来进行匀浆。

本研究结果显示3种方法分离线粒体的效率无明显差异，表明乳化分散仪法和玻璃匀浆器法虽然造成线粒体超微结构的损伤及功能受损，但并未造成线粒体数量上的明显减少。这得益于3种方法都是在低温环境中快速操作。低温环境能确保线粒体膜蛋白不被组织匀浆过程中释放的蛋白酶降解，同时快速操作有利于缩短线粒体外膜上脂类、氧化酶类和还原酶类与空气中氧气接触的时间，降低氧气等外界因素对线粒体的影响。

综上所述，本研究结果表明心肌组织线粒体提取过程中，除注意快速、低温外，研磨珠匀浆结合线粒体提取试剂盒、差速离心法，可以保证提取的线粒体形态结构完整、功能良好。