梁家宏，许侨东，严 江

(汕头大学医学院第一附属医院普外科，广东 汕头 515041)

肝细胞癌是最常见的致死性肿瘤之一。在全球范围内，肝细胞癌在所有的癌症相关死亡中排第2位，在最常见的肿瘤类型中排第6位[1]。我国肝癌的发病率和病死率均居第2位[2]。目前，手术切除仍然是治疗肝癌的主要措施，但是约60%的患者在行根治性肝切除术后5年内仍会经历肿瘤的复发或者转移，肝癌患者的远期预后仍不理想[3]。因此，对肝细胞癌的发病机制进行深入研究，从而为临床治疗提供理论依据，对于改善我国肝癌现状具有重要意义。

热休克蛋白90ABl(heat shock protein 90 kDa alpha，class B member 1，Hsp90AB1)是热休克蛋白90的4种亚型之一。热休克蛋白是ATP依赖的高度保守的分子伴侣，能够利用ATP水解产生的能量参与蛋白质的正确折叠，从而在细胞周期的运行，细胞的增殖、迁移、凋亡等过程中发挥重要作用[4-6]。目前的研究表明Hsp90AB1在多种肿瘤组织中过表达，并且在胃癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中具有促癌作用[7-9]。在肝细胞癌中，新近的研究发现Hsp90AB1具有促进血管生成的作用[10]。然而对于Hsp90AB1在肝细胞癌中的作用与机制仍有待进一步深入研究。本研究对Hsp90AB1在肝细胞癌中的生物学功能及作用机制进行探究，为肝细胞癌临床治疗发现新的靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

人正常肝细胞系L02及肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1均购自中国科学院上海细胞库，肝细胞癌组织芯片DLV013购自西安泰博斯生物科技有限公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录酶试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自大连宝生物工程有限公司，Bradford蛋白定量试剂盒购自美国Amresco公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司，SP法免疫组织化学检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，Hsp90AB1抗体购自苏州百远生物科技有限公司。NanoDrop 2000超微量紫外可见分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)，LightCycler 480荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化 将肝细胞组织芯片按照说明书进行Hsp90AB1蛋白的免疫组化染色。以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达，根据着色细胞占视野细胞总数的百分比及着色细胞染色的强弱作为免疫组化评分标准。着色细胞百分比：＞75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，6%～25%为1分，≤5%为0分。染色强弱：强(+++)3分，中(++)2分，弱(+)1分，阴性0分。两者的乘积作为免疫组化的评分。

1.2.2 qRT-PCR实验 按照TRIzol说明书对正常肝细胞系L02及肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1进行RNA提取。使用NanoDrop 2000分光光度计测量RNA浓度，通过A260/A280比值或者甲醛变性胶电泳实验检测RNA质量。质量合格的RNA根据反转录酶试剂盒说明书进行逆转录cDNA。逆转录体系为20 μL，依次加入RNA、 5 × PrimeScript buffer、 PrimeScript RT Enzyme Mix、RT Primer Mix、ddH2O，充分混匀，37℃15 min，85℃5 s。qRT-PCR的总反应体系为 10 μL，SYBR Green mix 5 μL，正反向引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1 μL。PCR反应条件为：95℃预热5 min，95℃变性10 s，60℃退火、延伸30 s，总共40个循环。以GAPDH作为内参，采用 2-ΔΔCt方法计算相对表达量。

1.2.3 生物信息学分析方法 肝细胞癌相关基因芯片GSE54238的基因数据在GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载获得。使用在线软件Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)分析正常肝组织和肝癌组织之间的差异表达基因。使用GEPIA数据库(http://gepia.cancerpku.cn/)分析Hsp90AB1在肝细胞癌和正常肝组织中的表达情况。使用GEPIA数据库对肝细胞癌患者根据Hsp90AB1的表达水平差异进行生存分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 20.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较用采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。生存分析使用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测Hsp90AB1在肝细胞癌组织芯片中的表达

肝细胞癌组织芯片包含40例正常肝组织和40例肝细胞癌组织。免疫组织化学检测结果显示：与正常肝组织相比，Hsp90AB1在肝细胞癌组织中表达上调(图1和图2)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 Hsp90AB1在肝细胞癌组织芯片中的表达 (免疫组织化学染色，上图×20，下图×40)

图2 Hsp90AB1在肝细胞癌组织中表达的免疫组化评分

2.2 生物信息学分析肝细胞癌相关基因芯片GSE54238差异表达基因

通过生物信息学方法对包括10例正常肝组织标本及13例晚期肝癌组织标本的基因芯片GSE54238进行分析，获得了50个在正常肝组织和肝细胞癌组织中差异表达的基因(差异倍数≥2，P＜0.05)，其中包含Hsp90AB1基因(NM_007355)。相比于正常肝组织，Hsp90AB1基因在肝细胞癌组织中表达上调(图3)。提示Hsp90AB1基因可能为肝细胞癌中潜在的关键基因。

图3 Hsp90AB1基因在肝细胞癌基因芯片中高表达

2.3 生物信息学分析Hsp90AB1基因在肝细胞癌组织样本中的表达

通过在线数据库GEPIA分析发现，与正常肝组织相比，Hsp90AB1基因在肝癌组织中过表达(P＜0.05)，图4。

图4 GEPIA数据库分析显示Hsp90AB1基因在肝细胞癌组织中高表达

2.4 生物信息学分析Hsp90AB1与肝细胞癌患者预后的相关性

通过在线数据库GEPIA分析发现，Hsp90AB1高表达的肝癌患者预后较差(P＜0.01)，图5。

图5 GEPIA数据库分析显示Hsp90AB1高表达的肝癌患者预后较差

2.5 Hsp90AB1基因在肝癌细胞系中的表达

通过qRT-PCR检测发现，相比于正常肝细胞系L02，Hsp90AB1基因在肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1中的表达均上调(P＜0.05)，图6。

图6 Hsp90AB1基因在肝癌细胞系中表达上调

3 讨论

目前由于缺乏有效的预后预测生物标志物及分子靶向机制研究进展缓慢，肝癌患者的预后仍较差。迫切需要寻找有效的分子标志物来改善肝癌患者的预后。Hsp90AB1属于Hsp90家族的一员。Hsp90是一种分子量大小为90 kDa的热休克蛋白，它能够维持主要细胞蛋白的功能，包括激素受体、蛋白激酶以及控制细胞周期和细胞凋亡的蛋白。它能够保护新翻译蛋白的正确折叠，也能促进未折叠蛋白的降解[11]。目前研究表明Hsp90AB1在多种实体肿瘤中表达异常并且与患者较差的预后相关。

有关Hsp90AB1在肝细胞癌中的研究不多。Meng等[10]研究发现Hsp90AB1能促进内皮细胞介导的肝癌细胞的血管形成。Xiao等[12]通过免疫相关基因芯片分析显示，Hsp90AB1可能为肝细胞癌中潜在的预后预测因子。Meng等[13]在体外实验中发现Hsp90AB1与肝癌组织中的血管生成拟态形成相关，并且能够促进微管形成，细胞迁移和侵袭。此外，Wang等[14]利用生物信息学对肝细胞相关基因芯片和临床数据进行分析，发现Hsp90AB1可能与自噬相关并且Hsp90AB1高表达患者的预后相对较差。本研究利用肝细胞癌组织芯片进行免疫组化实验，发现与正常肝组织相比，Hsp90AB1在肝细胞癌组织中表达上调。进一步对肝细胞癌相关基因芯片GSE54238进行生物信息学分析，发现Hsp90AB1基因在正常肝组织和肝癌组织中存在表达差异，提示Hsp90AB1基因可能为肝癌中潜在的关键基因。GEPIA数据库分析发现，与正常肝组织相比，Hsp90AB1基因在肝细胞癌组织中显著过表达。生存分析显示，Hsp90AB1高表达的肝癌患者预后相对较差。并且，相对于正常肝细胞系，Hsp90AB1基因在肝癌细胞系中高表达。

然而，本研究存在一定的缺陷。本研究仅从肝细胞癌组织样本、肝癌芯片及数据库分析发现Hsp90AB1在肝细胞癌中表达上调，并且表达高低与肝癌患者预后具有相关性。未进行Hsp90AB1表达与肝癌患者的临床病理学资料相关性的分析。未在体内及体外实验中探究Hsp90AB1对肝癌细胞生物学功能的影响。Hsp90AB1在肝细胞癌中的作用机制也有待进一步研究。

综上所述，通过对肝细胞癌组织样本研究及肝癌相关基因芯片数据经生物信息学分析验证，结果表明Hsp90AB1基因可能为肝细胞癌中潜在的促癌基因。进一步研究Hsp90AB1在肝细胞癌中的生物学功能及作用机制，有可能为探索肝癌临床诊疗的新靶点提供理论依据。