汤样华 杨振杰 莫亚峰 任国华 侯桥 辛大伟 曾林如

[摘要] 目的 觀察益肾除痹方对类风湿关节炎大鼠血清及关节滑膜细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、INF-γ的影响。 方法 选择24只类风湿关节炎大鼠随机分为模型组、阳性药物对照组、益肾除痹方低剂量组、益肾除痹方高剂量组，每组各6只，另取6只大鼠为空白组（正常组）。药物连续干预4周，于第2、4周，取大鼠血清及进行关节滑膜细胞培养，采用ELISA法检测大鼠血清及关节滑膜细胞中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量。 结果 模型组大鼠血清及滑膜细胞中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量均高于空白组（P<0.05）。阳性药物对照组和益肾除痹方高剂量组大鼠血清及滑膜细胞中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量均明显低于模型组（P<0.05）;而益肾除痹方低剂量组中除第2周所取血清中的TNF-α、IFN-γ和滑膜细胞中的TNF-α、IL-1β与模型组差异无统计学意义外，其余均明显低于模型组（P<0.05）。 结论 益肾除痹方治疗类风湿关节炎的作用机制与降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的水平有关。

[关键词] 益肾除痹方;类风湿关节炎;炎症因子;作用机制

[中图分类号] R245.81;R593.21          [文献标识码] A  &nbsp;       [文章编号] 1673-9701（2021）35-0027-05

Impacts of Yishen Chubi Prescription on inflammatory factors TNF-α， IL-1β and INF-γ in serum and joint synovial cells of rats with rheumatoid arthritis

TANG Yanghua   YANG Zhenjie   MO Yafeng   REN Guohua   HOU Qiao   XIN Dawei   ZENG Linru

Department of Orthopedics， Xiaoshan Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hangzhou， Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou   311201， China

[Abstract] Objective To observe the impacts of Yishen Chubi Prescription on inflammatory factors TNF-α， IL-1β and INF-γ in serum and joint synovial cells of rats with rheumatoid arthritis. Methods A total of 24 rats with rheumatoid arthritis were randomly divided into the model group（n=6）， the positive drug control group （n=6）， the low-dose Yishen Chubi prescription group（n=6） and the high-dose Yishen Chubi Prescription group（n=6）. Other rats were selected as the blank group （the normal group， n=6）. Drug intervention continued for 4 weeks. In the second and fourth week， rat serum and synovial cells were collected and cultured. And the contents of TNF-α， IL-1β and INF-γ in rat serum and synovial cells were detected by ELISA method. Results The contents of TNF-α， IL-1β and IFN-γ in rat serum and synovial cells of the model group were all higher than those of the blank group（P<0.05）. The contents of TNF-α， IL-1β and IFN-γ in rat serum and synovial cells in the positive drug control group and the high-dose Yishen Chubi prescription group were all significantly lower than those in the model group（P<0.05）. However， there were no statistically significant differences between TNF-α， IFN-γ in serum and TNF-α， IL-1β in synovial cells of the second week in the low-dose Yishen Chubi prescription group and those in the model group. Except for this， the rest indices were all significantly lower than those in the model group（P<0.05）. Conclusion The mechanism of function of Yishen Chubi Prescription in the treatment of rheumatoid arthritis is related to reducing the levels of inflammatory factors TNF-α， IL-1β and IFN-γ.

[Key words] Yishen Chubi Prescription; Rheumatoid arthritis; Inflammatory factors; Mechanism of function

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种较为常见的自身免疫性疾病，疾病发展后具有较高的致残性，并严重影响患者的生活和日常工作[1]。因RA致病因素及病理机制复杂多变，临床尚无特效治疗药物，目前也多采用联合用药治疗，以提高临床疗效[2-3]，但同时或多或少也存在药物副作用。因此，如何提高疗效，并降低RA致残率及药物副作用，改善患者生活质量，仍是当前临床治疗及研究的重点。中医药在RA的临床治疗有悠久的历史，且具有确切的疗效。中医学认为，RA其本在肾，其标在气血，肾藏精、主骨，肾精旺盛，则筋骨得养而关节滑利，肾虚则精髓不足，无以养骨，脏腑功能失调，引起气血失和、津液运行失调，阻滞经络，导致RA发生[4]。据此病机，前期我科临床上应用自拟益肾除痹方加减治疗RA，并取得较好的疗效，但相关作用机制尚不明确。目前TNF-α、IL-1、INF-γ是RA发病机制中主要的核心炎症细胞因子[5-7]。基于此，本研究通过使用弗氏完全佐剂（FCA）诱导法建立RA大鼠模型，并进行药物干预，旨在观察益肾除痹方对大鼠RA 模型血清及关节滑膜细胞TNF-α、IL-1β、INF-γ水平的影响，进一步探讨益肾除痹方对RA的疗效和作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康SPF级雄性成年Wistar大鼠30只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，動物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。每天光照、黑暗各12 h规律交替饲养，室温25℃，湿度60%～70%。所有动物自由饮水、进食。

1.2 主要试剂与仪器

益肾除痹方颗粒（药物组成：地黄10 g、山萸肉10 g、山药10 g、淫羊藿12 g、露蜂房6 g、制川乌5 g、半夏10 g、白芥子6 g、薏苡仁30 g、海风藤25 g、桂枝10 g、防己10 g，由杭州市萧山区中医院中药颗粒剂药房提供），完全弗氏佐剂（德国Sigma公司），雷公藤多苷片（浙江得思德制药有限公司），IL-1β、TNF-α、TGF-β试剂盒（江苏酶免实业有限公司），Citrate柠檬酸盐缓冲液、PBS磷酸盐缓冲液（北京百奥思科生物医学技术有限公司），生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司），酶标仪（美国MD公司），全自动脱水机、水浴缸、正置荧光显微镜（德国Leica公司），电子天平（上海花潮实业有限公司），加热磁力搅拌器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），微量加样器（德国Physiocare concept公司）。

1.3 造模与分组

使用弗氏完全佐剂（FCA）诱导法建立RA大鼠模型，具体方法：于左后脚底区注射0.1 mL完全弗氏佐剂，在注射的第1天，记录大鼠体重及左后脚掌体积，随后用体积描记器测量非注射脚掌的体积。在第21天时再次称重，并观察和根据评分分级评价继发性病变的严重程度：①耳朵：无小结、不红，计0分;有小结、色红，计1分。②鼻：结缔组织不肿胀，计0分;结缔组织严重肿胀，计1分。③尾：无小结，计0分;有小结，计1分。④前爪：无关节出现炎症表现，计0分;至少一个关节出现有炎症表现，计1分。⑤后爪：无关节出现炎症表现，计0分;关节表现为轻度炎症，计1分;中度炎症，计2分;严重炎症，计3分。继发反应达峰值时，对各组大鼠分别按上述分级评分方法进行评价，评分结果采用双样本异方差t检验进行比较分析，当大鼠各部位评分均表现为显著差异时，表明造模成功。无非常显著差异或只出现前足、耳、尾继发反应，均属淘汰样本。选择造模成功的24只大鼠随机分为模型组、阳性药物对照组、益肾除痹方低剂量组、益肾除痹方高剂量组，每组各6只。另取6只大鼠为空白组（正常组）。

1.4 方法

于造模成功后第2天分别给予药物干预，药物等效剂量根据大鼠体重及体表面积计算给药剂量，阳性药物对照组给予雷公藤多苷12 mg/（kg·d）灌胃;益肾除痹方颗粒1倍等效剂量为1.672 g/（kg·d），益肾除痹方低剂量组、益肾除痹方高剂量组每日予3 mL益肾除痹方颗粒溶液灌胃，剂量分别为1 倍等效剂量和2倍等效剂量;空白组与模型组给予等量的生理盐水灌胃;连续4周。

1.5 观察指标

1.5.1 酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量  药物干预后第2、4周，每组各取3只大鼠，使用抗凝管采集大鼠尾部静脉血5 mL，3500 r/min离心15 min，分离血清。试剂盒取出后在室温复温平衡20 min，蒸馏水将浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。取酶标包被板固定于框架上，并分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置。在标准品孔中加入 50 μL标准品;待测样本孔中先加入10 μL待测样本后，再加入40 μL样本稀释液;空白对照孔不加。然后在标准品孔、样本孔中每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体（空白孔除外），并用封版膜封住反应孔，然后在37℃水浴锅温育 60 min后弃液，吸水纸上拍干。每孔加满洗涤液，静置 1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次后，先后在每孔加入显色剂 A液、B液各50 μL，用手轻轻震荡混匀 30 s，37℃避光显色 15 min后取出酶标板，终止反应后，读取酶标仪上450 nm 处吸光度值。

1.5.2 ELISA检测大鼠滑膜细胞中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量  药物干预后第2、4周，断头处死大鼠，每组各3只，完整剥离踝关节滑膜组织，滑膜组织D-hanks缓冲液洗涤3遍后用眼科剪剪成2～3 mm3的小块，分别加入1 mL含15%小牛血清的DMEM完全培养液和0.2%胶原酶后，移入25 cm2培养瓶并置于37℃、5%CO2培养箱中，消化2.5 h后反复吹打，将未粘附的细胞移入离心管，1000 r/min离心10 min后弃上清液，加入4 mL的0.25%胰蛋白酶，然后移入25 cm2培养瓶并置于37℃、5%CO2培养箱中，消化30 min后去上清。将分离的滑膜细胞使用无D-hanks缓冲液冲洗3遍后重悬于含15%的小牛血清DMEM培养液中。然后采用台盼蓝排斥实验检测其活力是否大于95%和Giemsa染色，高倍镜下计数300个细胞，观察其纯度是否在95%以上。根据所检测的浓度合格细胞用上述DMEM配制成滑膜细胞悬液，细胞悬液浓度为5×105/L，将细胞悬液按每孔1 mL分别加入24孔培养板内，然后置于37℃、5%CO2培养箱中，培养48 h，800 r/min离心10 min后收集上清，然后经0.22 μm微孔滤膜进行过滤，滤过液置于-40℃保存。试剂盒从冰箱取出后在室温下复温平衡20 min，将蒸馏水浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。取酶标包被板固定于框架上，并分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置。在标准品孔中加入 50 μL标准品;待测样本孔中先加入10 μL待测样本后，再加入40 μL样本稀释液;空白对照孔不加。然后在标准品孔、样本孔中每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体（空白孔除外），并用封版膜封住反应孔，然后在37℃水浴锅温育 60 min后弃液，吸水纸上拍干。每孔加满洗涤液，静置 1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，先后在每孔加入显色剂 A 液、B 液 各50 μL，用手轻轻震荡混匀 30 s，37℃避光显色 15 min后取出酶标板，终止反应后，读取酶标仪上450 nm 处吸光度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量比较

模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均明显高于空白组（P<0.05）。与模型组相比，给药各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有降低趋势，其中阳性药物对照组血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有显著性降低（P<0.05）;益肾除痹方低剂量组中除第2周所取血清中TNF-α与IFN-γ仅有轻度下降外，其余均显著降低（P<0.05）;而益肾除痹方高剂量组第2周和第4周血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有显著性下降（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠滑膜细胞TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量比较

模型组大鼠滑膜细胞TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均高于空白组（P<0.05）。与模型组相比，给药各组大鼠滑膜细胞TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有下降趋势;其中阳性藥物对照组和益肾除痹方高剂量组大鼠滑膜细胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均显著下降（P<0.05）。益肾除痹方低剂量组，除给药第2周所取滑膜细胞中TNF-α与IL-1β，差异无统计学意义外，其余均显著下降（P<0.05）。见表2。

3 讨论

RA是一种以关节慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，并存在不同程度的关节功能障碍，常给患者的生活及工作带来较大的负面影响。随着人口老龄化和生活方式的改变，RA发病率也逐渐增长[8]。尽管目前对RA有较深入的研究，但对RA的具体发病机制尚不明确，并存在一定分歧。当前，炎症因子被公认为RA的主要致病因素，是炎症、感染和免疫性疾病的重要介质，是存在于细胞外的一组小分子多肽，主要由单核/巨噬细胞及淋巴细胞所产生的一系列炎症单核因子，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。在RA的急性滑膜炎症、滑膜纤维化、骨与软骨破坏等病理改变中炎症单核因子起重要作用[9]，其中IL-1（尤其是IL-1β）、TNF-α和IFN-γ起主导作用地位，并均由单核/巨噬细胞所产生。以往已有众多研究[10-12]表明，类风湿关节炎患者的外周血中单核细胞及关节滑膜液中的巨噬细胞，均能分泌产生IL-1、TNF-α、IFN-γ，并诱发外周血、关节滑液中的IL-1、TNF-α、IFN-γ水平升高。本研究采用弗氏完全佐剂诱导法建立RA大鼠模型，通过ELISA法检测大鼠血清和关节滑膜细胞发现，与空白组相比，模型组大鼠血清及滑膜细胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有显著性升高（P<0.05），进一步证实TNF-α、IL-1β、IFN-γ仍然是RA的主要炎症因子。

有研究[13-14]报道，在对类风湿关节炎患者的关节炎症部位的持续性细胞浸润和诱导组织破坏，IL-1、TNF-α起着更为直接的作用，并认为是发生骨质吸收、破坏以及关节软骨损伤的主要炎症细胞因子，其中与IL-1的作用更为密切。深入研究发现IL-1比TNF-α、IFN-γ更容易引起软骨和骨损伤[15]。因此，阻断IL-1、TNF-α、IFN-γ炎症因子对控制关节损伤至关重要，并可能是RA很好的治疗目标[16-17]。由于对RA的具体发病机制尚不清楚，目前西医治疗 RA的药物主要包括非甾体抗炎药、免疫抑制剂及糖皮质激素等，尽管能缓解病情，但不良反应也颇多。因此，深入研究RA的发病机制，寻求新的治疗药物，具有重要医学价值。而且现代医学也认为单一用药时药物作用靶点单一，不仅易产生耐药性，而且副作用也更为明显，而复方药物则具有多层次、多靶点疗效等特点[18]。益肾除痹方为我科治疗RA的自拟中药复方，具有补肝肾，祛风湿，通络止痛的功效，前期临床应用疗效确切，且副作用小，但其具体作用机制尚不明确。基于以上论述，本研究通过观察益肾除痹方对RA大鼠血清及滑膜细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量水平的影响，探讨其治疗RA的相关作用机制，以期为临床推广应用提供科学依据。本研究结果显示，益肾除痹方低剂量组中除第2周所取血清中TNF-α与IFN-γ仅有轻度下降外，其余均显著降低（P<0.05）;而益肾除痹方高剂量组第2 周和第4周血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有显著下降（P<0.05）。另外，益肾除痹方高剂量组大鼠滑膜细胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量也均显著下降（P<0.05）;益肾除痹方低剂量组，除给药第2周所取滑膜细胞中TNF-α与IL-1β差异无统计学意义外，其余也均显著下降（P<0.05），提示益肾除痹方治疗RA的作用与降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平相关。

综上所述，益肾除痹方治疗RA的作用机制与降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的水平有关。

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（收稿日期：2020-12-17）

[基金项目] 浙江省基础公益研究计划项目（LGF20H060001）;浙江省杭州市科技计划引导项目（20181228Y84）