马 威，杨家耀△，安 柳，邹 琦，章 消，刘 念

［1武汉市中西医结合医院（武汉市第一医院），湖北武汉 430022；2湖北中医药大学，湖北武汉430065］

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver dis⁃ease，NAFLD）是全球肝病最重要的病因之一，在未来几十年内，NAFLD 可能成为终末期肝病的主要病因，严重影响成人及儿童［1］。NAFLD 已成为全球人类主要的健康负担，其可导致肝硬化、肝细胞癌、糖尿病和心血管疾病等的风险增加［2］。研究显示，NAFLD 的患病率与人民生活水平呈显著正相关性，其已经成为21 世纪全球公认的公共健康问题之一［3］。NAFLD 是临床上常见的病理综合征，目前针对NAFLD 的治疗尚未有明确有效的方案［4］。近些年，有关NAFLD 发病的“多重打击”学说逐渐兴起，其认为NAFLD 是由饮食、遗传和环境等因素共同作用的结果，其中，炎症因子失衡是其病情发展过程中致肝细胞损伤的重要病理基础，典型的炎症反应则是NAFLD 的主要病理表现之一［5］。Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）能激活核因子κB（nucle⁃ar factor kappa B，NF-κB），使其进入细胞核内，激活靶基因的转录发生，引起一系列的细胞因子合成与释放，触发机体产生级联式炎症反应，最终诱发一系列的免疫及炎症反应［6］。中医疗法在NAFLD 临床治疗上具有一定的优势，本课题前期研究发现附子理中汤（Fuzilizhong decoction）在NAFLD 细胞模型和动物模型中均可发挥作用［7-8］。本研究在前期研究的基础之上，从炎症损伤方面探究附子理中汤对NAFLD模型大鼠的作用及机制。

材料和方法

1 动物与主要试剂

48 只7～8 周龄雄性SPF 级SD 大鼠，体重（250±25）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司［SCXK（辽）2017-0012］。易善复（Yishanfu）购自赛诺菲北京制药有限公司；附子理中汤配方为人参9 g，白术9 g，炙甘草6 g，干姜9 g，炮附子9 g，该方剂的中药饮片购于湖北天济中药饮片有限公司。检测白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、肿瘤坏死因子α（tumor ne⁃crosis factor-α，TNF-α）和IL-6 含量的ELISA 试剂盒购于武汉贝茵莱生物科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa；SYBR Green 染料购自Lumiprobe Cor⁃poration；BCA 蛋白浓度检测试剂盒和化学发光试剂购自南京建成生物技术有限公司；兔抗TLR4抗体和兔抗NF-κB p65 抗体、兔抗p-NF-κB p65 抗体和兔抗GAPDH抗体购自Abcam。

2 实验方法

2.1 构建大鼠NAFLD 模型 采用脂肪乳灌胃法制备大鼠NAFLD 模型［9-10］。脂肪乳由A 液（25 g 猪油加热溶解，加入10 g 胆固醇，搅拌后加入1 g 丙赛优，混匀后加入25 mL 吐温80）和B 液（取20 mL 丙二醇至30 mL 水中，加热至60℃，加入2 g 脱氧胆酸钠）混合而成。向脂肪乳中加水至100 mL，灌胃剂量为10 mL·kg−1·d−1，持续4周。

2.2 动物分组及治疗 48 只SD 大鼠随机分为6组：（1）对照（control）组：10 mL·kg−1·d−1生理盐水灌胃8 周；（2）模型（NAFLD model）组：10 mL·kg−1·d−1脂肪乳灌胃4 周，10 mL·kg−1·d−1生理盐水灌胃4 周；（3）附子理中汤高剂量组：10 mL·kg−1·d−1脂肪乳灌胃4 周，20 mL·kg−1·d−1附子理中汤灌胃4 周；（4）附子理中汤中剂量组：10 mL·kg−1·d−1脂肪乳灌胃4周，10 mL·kg−1·d−1附子理中汤灌胃4周；（5）附子理中汤低剂量组：10 mL·kg−1·d−1脂肪乳灌胃4 周，5 mL·kg−1·d−1附子理中汤灌胃4 周；（6）易善复组：10 mL·kg−1·d−1脂肪乳灌胃4 周，30 mL·kg−1·d−1易善复灌胃4 周。造模4 周后，各造模组中随机挑选1 只大鼠进行肝组织HE 染色后病理分析，鉴定模型是否成功。治疗结束后，采用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取腹主动脉血5 mL，分离血清；大鼠颈椎脱臼处死，取肝脏组织，多聚甲醛固定部分组织用于病理观察，其余组织置于−80℃中保存。

2.3 HE 染色观察病理学变化 将大鼠肝脏组织从固定液中取出，烘干脱水，浸蜡包埋。将包埋组织切成厚度为4 μm 左右的切片。烤片后，采用苏木素、伊红染液分别染色。流水冲洗后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。中性树胶封片后，于显微镜下观察大鼠肝组织病理学变化。

2.4 ELISA 检测血清IL-2、IL-6 及TNF-α 含量 取分离后的各组大鼠新鲜血清，分别按ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清中IL-2、IL-6 和TNF-α的水平。

2.5 RT-qPCR 检测肝组织中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 表达 加入Trizol 提取大鼠肝组织总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板进行RTqPCR。反应程序为：95℃5 s，56℃30 s，72℃25 s，共35 个循环。TLR4 的上游引物序列为5´-ACCT⁃GTCCCTGAACCCT-3´，下游引物序列为 5´-CTCCCAGAACCAAACGA-3´；NF-κB p65的上游引物序列为5´-GGGGACTACGACCTGAATG-3´，下游引物序 列 为5´-GGGCACGATTGTCAAAGAT-3´；GAPDH的上游引物序列为5´-CCACTCCTCCACCTTTG-3´，下游引物序列为5´-CACCACCCTGTTGCTGT-3´。由上海生物工程有限公司合成。

2.6 Western blot 检测肝组织中TLR4 及p-NF-κB p65蛋白的表达 提取大鼠肝组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg 蛋白上样，经SDS-PAGE 分离后，将蛋白转移到PVDF 膜上。封闭1 h，加入Ⅰ抗稀释液（TLR4 稀释比为1∶1 000；NF-κB p65 稀释比为1∶2 000；p-NF-κB p65 稀释比为1∶5 000；GAPDH 稀释比为1∶2 500），室温孵育1 h。PBS 清洗3 次，加入HRP 标记的Ⅱ抗稀释液（1∶5 000），室温孵育0.5 h。PBS 清洗5 次，加入ECL 化学发光试剂，于暗室中显影曝光，根据灰度值计算蛋白相对表达量。

3 统计学处理

采用统计软件SPSS 19.0进行分析，实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较选择单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NAFLD大鼠肝组织病理学的变化

HE 染色结果显示，对照组大鼠肝小叶结构清晰，细胞形态正常，排列有序；模型组大鼠肝细胞出现肿胀，排列无序，细胞间连接松散，细胞内存在脂滴空泡，细胞核着色深并出现裂解，且有明显的炎症细胞浸润现象；附子理中汤低、中、高剂量组肝细胞形态逐渐恢复，肿胀程度逐渐减轻，脂滴空泡现象逐渐减少，炎症细胞浸润逐渐减少，且以附子理中汤高剂量组及易善复组大鼠肝组织损伤改善更佳。见图1。

Figure 1.The effect of Fuzilizhong decoction on pathological changes of liver tissue in rats with NAFLD.图1 附子理中汤对NAFLD大鼠肝组织病理学变化的影响

2 NAFLD 大鼠血清炎症因子IL-2、IL-6 及TNF-α水平的比较

ELISA 结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平显著降低（P＜0.05）；与附子理中汤低、中剂量组比较，附子理中汤高剂量组大鼠血清IL-2、IL-6 及TNFα 水平显著降低（P＜0.05），提示附子理中汤对NAFLD 大鼠血清炎症因子的抑制作用呈剂量依赖性。见表1。

3 附子理中汤抑制NAFLD 大鼠肝组织中TLR4 及NF-κB p65的表达

RT-qPCR 和Western blot 结果显示，与对照组比较，模型组肝组织中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠肝组织中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 显著降低（P＜0.05）；与附子理中汤低、中剂量组比较，附子理中汤高剂量组大鼠肝组织中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 显著降低（P＜0.05）。而各组肝组织中TLR4及p-NF-κB p65 的变化趋势与mRNA 变化一致。见图2、3。

表1 NAFLD大鼠血清IL-2、IL-6及TNF-α水平的比较Table 1.Comparison of serum levels of IL-2，IL-6 and TNF-α in rats with NAFLD（Mean±SD. n=7）

Figure 2.Comparison of the mRNA levels of TLR4 and NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoction group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.图2 NALFD大鼠肝组织中TLR4及NF-κB p65 mRNA表达水平的比较

讨 论

NAFLD 是一种最普遍的肝脏疾病，全球的发病率约为25.24%［11］。研究证明，NAFLD的临床负担不仅局限于肝脏相关疾病，更是一种多系统疾病，可影响肝外器官和多种调节途径［12］。目前，NAFLD 的发病机制尚未明确，接受度最高的机制为“二次打击”学说［13］。“二次打击”学说及其所致的炎症反应在NAFLD病理过程中具有关键性作用［14］。临床上多使用胰岛素增敏剂、抗氧化剂和降脂药物等进行治疗，由于这些药物长期使用多引发毒副作用，使得中草药和天然产物成为人们寻找来治疗NAFLD 的理想药物［15-16］。

在中医药历史中，并没有以“脂肪肝”命名的疾病，脂肪肝被称为“肝积”，其临床表现可归纳为“肝痞”、“肝壅”、“胁痛”、“积聚”及“痰方”等范畴，其病位主要在肝脏，涉及脾脏与肾脏［8，17］。有学者认为以温阳化气为主，恢复其脾胃功能为肝积的治疗方案［18］。中药汤剂附子理中汤由人参、白术、炙甘草、干姜和炮附子制成，人参，其主要成分人参皂苷——具有抗氧化作用，可发挥保肝护肝功效［19］；白术可有效改善NAFLD 患者血脂水平，具有明显的治疗效果［20］；炙甘草活性成分甘草素具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性，并具有抑制肝纤维化的作用［21］；而干姜可温运健脾，炮附子可回阳救逆。临床资料也显示，采用中药附子理中汤加痛泻要方加味治疗脂肪肝患者2 个月，可降低其血脂和转氨酶，改善症状［22］。本研究结果也显示，附子理中汤能改善NAFLD 大鼠肝脏损伤，有效降低血清炎症因子水平。

Toll 样受体家族（TLRs）是具有典型特征的一类模式识别受体，在激活先天性免疫应答中起着重要作用［23］。TLR4 不仅能识别多种外源性配体，也能识别与炎症、应激和机体损伤等相关的内源性配体，其与配体结合后主要通过活化髓样分化因子88 依赖和非依赖性信号途径，激活NF-κB 从而引发一系列的炎症和免疫反应［24］。在本研究中，附子理中汤可以抑制TLR4/NF-κB 信号通路，降低炎症因子IL-2、TNF-α及IL-6在NAFLD模型大鼠血清中的水平。

Figure 3.The effect of Fuzilizhong decoction on the protein levels of TLR4 and p-NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoc⁃tion group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.图3 附子理中汤对NAFLD大鼠肝组织中TLR4及p-NF-κB p65蛋白表达水平的影响

综上所述，附子理中汤可减轻NAFLD 大鼠肝脏的炎症反应，其可能的作用机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。