田 莉，陈 文，骆元斌，黄小玲

（甘肃省中医院 1病理科，2足踝骨科，甘肃兰州 730050）

宫颈癌是女性最为常见的生殖系统恶性肿瘤之一，发病率在我国女性恶性肿瘤中居第2 位［1-2］。持续感染高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papil⁃lomavirus，HR-HPV）是宫颈上皮内瘤变（cervical in⁃traepithelial neoplasia，CIN）和宫颈癌的主要原因［3］。E6 和E7 基因是HPV 癌基因，其表达产物E6 和E7 蛋白是致癌的关键［4-5］。有研究表明，HPV DNA检测并不能准确反映HPV 感染后的活化状态，而E6 和E7基因无论在HPV 游离或整合状态均存在，是促进宫颈上皮细胞恶变的重要分子［6-7］，因此检测HPV E6/E7 mRNA对宫颈鳞状上皮内病变的筛查和诊断要优于HPV DNA 检测。本研究通过回顾性统计HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA 病例的分析比较，初步探讨两者在筛查宫颈鳞状上皮内病变的应用价值。

材料和方法

1 一般资料

回顾性收集2018 年10 月～2019 年10 月甘肃省中医院病理科行液基薄层细胞学检查（ThinPrep cy⁃tology test，TCT）患者标本共206 例，年龄22～73 岁，平均年龄42.13 岁，中位年龄42 岁，排除既往CIN史、自身免疫疾病史、妊娠史、子宫切除史，取材前3 d内无性生活史。

2 实验方法

2.1 TCT 使用TCT专用宫颈刷采集宫颈细胞样本，采集宫颈表面及移行带的宫颈脱落细胞，在细胞保存液瓶中漂洗后，放入全自动细胞制备仪器，通过混匀、过滤、转移、贴附、巴氏染色后显微镜下观察诊断。根据2001 年国际癌症协会推荐的泊赛斯达系统（the Bethesda system，TBS）分类标准新改版（TBS-2014）进行阅片判读。结果分为：（1）未见上皮内病变细胞或恶性病变（no intraepithelial lesion or malignancy，NILM）；（2）意义不明确的非典型鳞状上皮细胞（atypi⁃cal squamous cells of undetermined significance，ASCUS）；（3）低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；（4）不能除外高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞（atypical squa⁃mous cells，cannot exclude high-grade squamous in⁃traepithelial lesion，ASC-H）；（5）高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。

2.2 HPV DNA 检测 采用HC2 法检测HPV DNA，使用化学发光检测杂交信号放大技术，对14 种高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）和5种低危型HPV（6、11、42、43和81）基因型进行分型检测。

2.3 HPV E6/E7 mRNA基因检测 试剂盒和仪器均购自河南科蒂亚生物技术有限公司，采用bDNA法，针对14种高危HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）检测，主要步骤包括裂解细胞、杂交捕获mRNA、信号放大、底物发光反应，经Quanti-VirusTM冷光仪检测光子数，计算机软件转换出HPV E6/E7 mRNA拷贝数，自动判读结果，拷贝数＞0为阳性。

2.4 阴道镜检查及宫颈活检 细胞学出现ASC-US以上结果的标本，于阴道镜下活检，行病理组织学检查，结果分为正常/炎症、低级别鳞状上皮内病变、高级别鳞状上皮内病变和鳞状细胞癌。

2.5 免疫组化法检测p16 表达 对活检的标本，同时使用小鼠抗人p16单克隆抗体，经罗氏免疫组化自动系统染色，结果参照CINtec p16 结果判读说明书。根据组织中阳性细胞的表达情况，阳性结果为宫颈鳞状上皮全层或基底层至副基底层的细胞呈连续弥漫着色（任何强度的连续弥漫着色均视为阳性），定位于细胞核和（或）细胞浆；而宫颈鳞状上皮不着色或孤立、小灶不连续的细胞着色均判读为阴性结果。

3 统计学处理

本研究采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义；将组织学结果诊断为LSIL 及更严重结果的病例以灵敏度、特异度和阳性预测值对HPV E6/E7 mRNA、HPV E6/E7 DNA和p16检测方法进行性能比较。

结 果

1 标本分组结果

将筛选的206 例患者行TCT 检测，结果为NILM 93 例（45.1%），ASC-US 50 例（24.3%），LSIL 40 例（19.4%），ASC-H 7 例（3.4%），HSIL 16 例（7.8%）；HPV E6/E7 mRNA 检测阳性为78 例（37.9%），HPV E6/E7 DNA 检测阳性为99 例（48.1%）。将诊断结果为ASC-US 及更严重病变的113 例标本行宫颈活检并做病理组织学检查及p16 免疫组化染色，结果显示正常/炎症20 例（17.7%），LSIL 53 例（46.9%），HSIL 33 例（29.2%），宫颈鳞状细胞癌7 例（6.2%），p16阳性表达46例（40.7%）。

2 不同细胞病理学分级HPV E6/E7 mRNA 和DNA结果的对比情况

对NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H和HSIL这5种细胞病理学分级中HPV E6/E7 mRNA 和DNA检测结果进行统计，发现HPV E6/E7 mRNA 的阳性率分别为22.6%、22.0%、70.0%、71.4%和81.3%（χ²=48.293），HPV E6/E7 DNA的阳性率为24.7%、54.0%、70.0%、85.7%和93.8%（χ²=46.053），均随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势（P＜0.05）；在ASC-US 中，HPV E6/E7 mRNA 与HPV E6/E7 DNA 检出率的差异有统计学意义（P＜0.05），而在NILM、LSIL、ASC-H 和HSIL 中，两者检出率的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

表1 不同细胞病理学分级HPV E6/E7 mRNA和HPV E6/E7 DNA检出结果统计Table 1.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different cytopathological grades

3 不同组织病理学分级HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA结果的对比情况

将细胞病理学诊断结果为ASC-US 及更高级别病变的113 例标本进行病理组织学活检并统计分析，结果显示正常/炎症、LSIL、HSIL 及鳞状细胞癌4种分级中HPV E6/E7 mRNA 的阳性率分别为20.0%、43.4%、69.7% 和100.0%（χ²=20.238），HPV E6/E7 DNA 的阳性率为30.0%、69.8%、78.8%和100.0%（χ²=18.164），均随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势（P＜0.05）。由于鳞癌的例数较少（7 例），且两者检出率相同（阳性均为7/7，100%），故将HSIL 与鳞癌例数合并统计，结果显示LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 与DNA 检出率的差异有统计学意义（P＜0.05），而正常/炎症、HSIL 和鳞癌中两者检出率的差异无统计学显著性（P＞0.05），见表2。

表2 不同组织病理学分级HPV E6/E7 mRNA与HPV E6/E7 DNA检出结果统计Table 2.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different histopathological grades

4 p16在不同组织病理学分级下检出结果比较

对行组织学病检的113例标本同时做p16免疫组化染色，结果显示正常/炎症组未见p16 表达，LSIL、HSIL 及鳞癌组的阳性率分别为18.9%（10/53）、87.9%（29/33）和100.0%（7/7），随宫颈鳞状上皮内病变的进展而增高，差异有统计学意义（P=0.000）。

5 HPV E6/E7 mRNA 和DNA 对宫颈鳞状上皮内病变的诊断评估

以组织病理学结果（LSIL 及更严重病变）作为阳性结果，分别通过灵敏度、特异度和阳性预测值评估HPV E6/E7 mRNA 和DNA 对宫颈鳞状上皮内病变的诊断价值。采用单个检测及与p16 联合检测的方法，在统计与p16 联合检测时，将任何一项阳性定义为阳性结果（由于鳞癌样本过少，与HSIL 组一起统计）。结果显示，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA+p16 灵敏度最高，阳性预测值高于HPV E6/E7 mRNA+p16，但低于单用HPV E6/E7 DNA，HPV E6/E7 mRNA+p16 特异度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于单用HPV E6/E7 mRNA；在HSIL+鳞癌中HPV E6/E7 DNA+p16 灵敏度最高，HPV E6/E7 mRNA+p16 特异度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于单用HPV E6/E7 mRNA，而阳性预测值最高，见表3。

讨 论

宫颈癌的发生与持续感染HR-HPV 有关［8-9］，HPV 可以感染宫颈基底层细胞，其DNA 游离在细胞核内，通过整合到细胞染色体，导致癌变［10-11］。HPV大多数是一过性感染，可自行消退，只有1/3 病例呈持续状态，当机体接触致癌因素或免疫水平降低时，经历5～10 年会发展为CIN 和宫颈癌。目前，临床使用TCT 与HPV DNA 检测方法联合筛查宫颈癌，由于大部分患者感染HPV后可通过自身免疫功能清除病毒［12］，病变恶化时间较长，因此HPV DNA 检测方式对宫颈癌发生的预测过早，并不能反映病毒感染后的活化状态［13］。而病毒整合到宿主细胞后，HPV E6和E7 癌基因过表达，分别通过结合抑癌蛋白p53 和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）等［14-15］，造成细胞周期紊乱，使被病毒感染的细胞异常增殖，促进肿瘤的发生。因此有研究显示，HPV E6/E7 mRNA 检测更有助于判断宫颈病变的进展［16］。本研究发现，在NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H 和HSIL 细胞病理学分级中HPV E6/E7 mRNA 和DNA的检出率均随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势（P＜0.05），且HPV E6/E7 mRNA 检出率均低于HPV E6/E7 DNA 检出率，在ASC-US 中两者检出率差异有统计学意义，说明HPV DNA 检测确实不能反映HPV 整合活化的状态，这与Johansson等［17］的研究结果相一致。

表3 不同检测方法在宫颈鳞状上皮内病变效能对比Table 3.Comparison of efficiency of different detection methods in cervical squamous intraepithelial lesions（%）

本研究对ASC-US 及更高病变的病例行活检及组织病理学诊断，结果显示HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的检出率随宫颈鳞状上皮内病变的进展呈递增趋势，在LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 的检出率低于HPV E6/E7 DNA，差异有统计学意义，这与细胞学结果一致，也从组织病理学角度说明HPV E6/E7 DNA检测的是游离状态下的DNA，阳性患者多数可能为一过性感染，易出现假阳性。

目前临床治疗CIN强调个体化，LSIL仅需随诊，不需手术，而HSIL 则需要临床治疗［18］，因此在诊断CIN 时出现一些需要注意的问题［19］：第4 版WHO（2014）女性生殖系统肿瘤分类中将CIN 诊断分为LSIL 及HSIL，LSIL 包括CIN1、湿疣等，HSIL 包括CIN2、CIN3及鳞状上皮原位癌。由于CIN2可能包含部分LSIL 及部分HSIL，笼统将CIN2 归于HSIL，可能会导致HSIL扩大化，临床过度治疗［11，18］，因此需要将这样的情况再进行区分。有研究表明，通过免疫组化染色检测p16 的表达，对区别两者有帮助。p16 是一种细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent ki⁃nases，CDKs）抑制剂，通过抑制CDK4 活性，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。当p16基因突变，CDK4活性增强，进而引起细胞分裂加速，细胞恶性增殖［20-21］。在HPV 持续感染所致的高级别病变中，p16 呈连续大块状深棕色染色，而在低级别病变中，p16 一般为阴性（阴性或不连续灶状阳性）［18］。本研究结果显示，p16 的表达阳性率随宫颈鳞状上皮内病变级别的增高而增高，这与Gregg 等［22］和Kl⁃aes等［23］的研究结果一致。而本研究在检测HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的同时加上p16 免疫组化染色，通过对敏感度、特异度和阳性预测值的统计，评估两种检测方法对宫颈鳞状上皮内病变的诊断价值，结果显示，HPV E6/E7 DNA+p16 灵敏度最高，HPV E6/E7 mRNA 特异度最高，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA 阳性预测值最高，而HSIL+鳞癌中HPV E6/E7 mRNA+p16阳性预测值最高，这也与目前的研究结果一致。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA 与HPV E6/E7 DNA 检测相比，可以更好地反映HPV 的活化状态，在筛查鳞状上皮内病变时，避免给患者带来生理和经济上的负担，而在诊断高级别病变时，为避免在临床筛查时过度检查与治疗，可进行p16 免疫组化染色，这样更准确地给予临床参考依据，以便于临床进行个体化治疗。由于本研究样本数量较少，尤其是HSIL 病例收集不足，HPV E6/E7 mRNA 和DNA 两种检测方法在临床诊断过程中应该联合采用还是在某种条件下单一采用，还需要更多临床数据的验证、支持以及进一步的研究探讨。