潘吉脉 ，吴良涛 ，杨霞 ，程振涛 ,2,3，姜海波 ,2,3，文明 ,2,3

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物生物制品工程技术中心，贵州 贵阳 550025；4.黔南民族职业技术学院现代山地农业工程系，贵州 都匀 558000）

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila隶属弧菌科、气单胞菌属，是一种革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于淡水、污水、土壤及人体粪便中。鱼感染该菌后鳃部、体表出血溃烂，内脏发白，可引起急性胃炎、肠炎等病症，是一种典型“人-兽-鱼”共患病原菌。近年来由嗜水气单胞菌引发水生动物的病例不断增多，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌[1]。该菌严重威胁水产养殖业的发展和人类健康[2]。研究表明，选择具有代表性的免疫原性好的嗜水气单胞菌菌株，制备灭活疫苗，用于鱼类浸泡或注射免疫，在鱼类嗜水气单胞菌病防控上取得了良好效果[3,4]。在规模化生产菌体过程中，细菌的数量和致病力受温度、盐度、pH、碳源、氮源等培养条件的影响[5]。本试验通过研究不同培养条件下嗜水气单胞菌的生长，优化工业化生产嗜水气单胞菌的培养条件，以期为嗜水气单胞菌工业化生产该菌灭活疫苗及防控鱼类嗜水气单胞菌病提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌GZ1株由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存。

胰蛋白胨、酵母粉与琼脂糖均购自上海博微生物科技有限公司；NaCl购自重庆川江化学试剂公司；HCl（分析纯度38%）和NaOH（分析纯度32%），均购自杭州联科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸镁等均购自上成都市科龙化工试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养方法

将菌株划线接种在以胰蛋白胨为氮源、酵母粉为碳源的LB固体培养基上，37℃恒温培养24h，挑取单个菌落，接种LB液体培养基，30℃摇床振荡培养 24h，8000r/min，离心 5min，取菌体，用无菌 PBS洗涤3次，取沉淀，配制成浓度为1×108cfu/mL菌悬液，4℃保藏备用。

1.2.2 不同培养条件对嗜水气单胞菌GZ1株生长状况的影响

取培养24h菌液，8000r/min离心5min，取菌体，无菌PBS洗涤3次，取菌悬液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀释，用平板计数法测定菌液细菌含量，以无菌PBS为对照，以菌液细菌含量为Y轴，菌液OD600为X轴，构建回归方程。

生长曲线的测定：将上述菌液接种于LB液体培养基，30℃摇床振荡（180r/min）培养，用分光光度计测定培养第 2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h 菌液 OD600[6]，用回归方程公式计算细菌浓度，以培养时间为横坐标，细菌浓度为纵坐标，绘制嗜水气单胞菌生长曲线。

温度：培养温度分别设为 4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较温度对GZ1株生长的影响。

pH：用NaOH和HCl调节培养基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每个处理设3个重复，24h时以无菌LB液体培养基为对照，比较pH对GZ1株的影响。

NaCl浓度：分别调制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液体培养基，加入1%对数期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振荡培养24h，以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较NaCl浓度对GZ1株生长的影响。

Mg2+浓度：添加硫酸镁，调制Mg2+浓度分别为1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和 10 mg/L的 LB培养基，培养24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较Mg2+浓度对GZ1株生长的影响。

碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、碳酸钠配制成碳浓度为0.42 g/L的不同碳源培养基，培养24h时以无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较碳源对GZ1株生长的影响。

氮源：用氯化铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮浓度为0.71g/L的不同氮源培养基，加入1%对数期GZ1株菌液30℃、180 r/min振荡培养24h，无菌LB液体培养基为对照，每个处理设3个重复，比较氮源对GZ1株生长的影响。

1.2.3 正交试验设计

在单因素对嗜水气单胞菌GZ1株生长影响的基础上，取温度、pH、NaCl浓度、Mg2+浓度4个因素作为考察因素，每个因素设3个水平，以细菌浓度为指标，设计正交试验表1。

表1 正交试验设计表Tab.1 An orthogonal test design table

1.2.4 数据处理

结果以平均数和标准偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 嗜水气单胞菌GZ1株的浓度与OD600的线性方程与生长曲线

细菌含量与OD600成线性关系（图1），其回归方程为：Y=17.65X+0.43，Y 为细菌含量 （×108cfu·mL-1），X 为 OD600。

图1 嗜水气单胞菌GZ1株的浓度与OD600的线性方程Fig.1 The linear equation between density of A.hydrophila GZ1 strain and OD600value

由图2可知，在30℃时，前12h为该菌生长延迟期，12～24h 为生长对数期，24～36h 为生长稳定期，36 h后进入衰亡期。

图2 嗜水气单胞菌GZ1株生长曲线Fig.2 Growth curve of GZ1 strain of A.hydrophila

2.2 不同培养条件对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响

2.2.1 温度对GZ1株生长的影响

由图3可知，除28℃与30℃两组外，其他各温度组间GZ1株生长差异显著（P＜0.05），4℃时GZ1株几乎不生长，在25～37℃生长良好，菌液浓度较高，而在25℃时生长最好，菌液浓度最高，达到18.73×108cfu/mL。

图3 温度对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响Fig.3 Effect of temperature on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.2 pH对GZ1株生长的影响

由图4可知，pH在5.5～8.0之间对GZ1株生长影响不同，在pH6.0、7.0 间生长差异不显著（P＞0.05），其他pH生长差异显著（P＜0.05），pH6.5时菌液浓度最高（20.11×108cfu/mL），pH8.0时菌液浓度最低（10.60×108cfu/mL）。

图4 pH对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响Fig.4 Effect of pH on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.3 NaCl浓度对GZ1株生长的影响

由图5可知，NaCL浓度为0%～5%对GZ1株生长的影响差异显著（P＜0.05），NaCL浓度为0%和5%时，该菌几乎不生长，而NaCl浓度为2%时，细菌生长最好，菌液浓度最高，为31.61×108cfu/mL。

图5 NaCL浓度对嗜水气单胞菌GZ1株的影响Fig.5 Effect of NaCL concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.4 Mg2+对GZ1株生长的影响

由图6可知，不同浓度Mg2+对GZ1株生长影响差异显著（P＜0.05），Mg2+浓度为 2.5 mg/L时,细菌浓度最高,为 30.43×108cfu/mL，Mg2+浓度过高，细菌浓度反而降低，说明细菌浓度不随Mg2+浓度高而增加。

图6 Mg2+浓度对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响Fig.6 Effect of Mg2+concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.5 碳源对GZ1株生长的影响

由表2可知，碳源影响GZ1株的生长，以碳酸钠和柠檬酸为碳源时，几乎不生长，菌液浓度最低，仅为0.52×108cfu/mL左右，而碳源为蔗糖时，菌液浓度最高（9.85×108cfu/mL），说明蔗糖适合作为该菌碳源。

表2 碳源对嗜水气单胞菌生长的影响Tab.2 Effect of carbon source on A.hydrophila

2.2.6 氮源对GZ1株生长的影响

由表3可知，以蛋白胨和胰蛋白胨为氮源时，GZ1株生长良好，氮源为蛋白胨时，菌液浓度最高，而氮源为尿素和氯化铵时，GZ1株几乎不生长，这说明氮源影响GZ1株的生长。

表3 氮源对嗜水气单胞菌生长的影响Tab.3 Effect of nitrogen source on growth of A.hydrophila

2.2.7 正交试验结果

由表4可知，4个考察因素中，温度对该菌生长影响最大，Mg2+浓度次之，pH影响最小，最优组合是A2B2C2D2，即 25℃、pH 6.5、2%的 NaCl和 2.5mg/L 的Mg2+。

表4 正交实验结果Tab.4 Orthogonal experiment results

3 讨论

嗜水气单胞菌可引起多种动物败血症，特别是水产养殖动物。用抗生素药物防治嗜水气单胞菌病易产生耐药性，疫苗免疫是防控嗜水气单胞菌病的主要手段，而要获得免疫原性好的嗜水气单胞菌，在大规模生产菌体过程中须充分利用其生长繁殖规律。研究表明，处于对数增长期的细菌酶活性高、繁殖率高和致病性强[7]，而被用于灭活疫苗的研发。

本研究采用分光光度计测定不同培养条件下嗜水气单胞菌菌液的OD，探究不同培养条件对嗜水气单胞菌GZ1株生长的影响。结果显示，GZ1株的最适合生长温度为25℃，这与Miyata等的报道一致，但与Huys等[8-12]报道不一致，这可能是由于各地菌株存在着差异，因而生理生化试验结果也存在着差异。pH影响细菌，改变细胞膜上的电荷，从而影响细菌对营养物质的吸收和酶活性[13]；多数病原菌的最适合pH为中性或弱碱性环境中生长，本次研究结果显示：该菌的最适生长pH为6.5的弱酸性环境。有资料显示：初始pH为7.0的培养基，接种嗜水气单胞菌培养后，再测发现培养基pH降低，提示嗜水气单胞菌生长繁殖可以产酸；于华[14]等研究发现：产酸芽孢杆菌的最适生长pH为5.5，孙鹏飞[15]等研究表明：食窦魏氏菌Weisella cibaria、巴氏醋酸杆菌Acetobacter pasteurianus最适培养pH分别为6.5与6.0。本研究显示嗜水气单胞菌GZ1株的最适生长pH为6.5的弱酸性环境，可能是产酸菌最适酸性环境中生长，与自身产酸存在一定关系。NaCl的浓度通过渗透压来影响细菌的生长繁殖。本研究发现，该菌的最适生长繁殖NaCl浓度为2%，NaCl浓度为0%和5%时，细菌几乎不生长，可能是培养基中的渗透压比菌体内渗透压过低或过高所致。

细菌的生长繁殖需要碳源、氮源、无机盐、水和生长因子。在LB液体培养基中，酵母粉是细菌的主要碳源，为细菌提供能量；胰蛋白胨是主要氮源，为细菌提供合成蛋白质与核酸的原料。不同碳源、氮源的结构不同，被细菌的利用程度与代谢方式也不一样[16]。本次研究中，蔗糖作为嗜水气单胞菌唯一碳源时，细菌浓度最高，为该菌培养条件的优化提供参考。蛋白胨为嗜水气单胞菌唯一氮源时，细菌浓度最高，蛋白胨促进嗜水气单胞菌的生长繁殖；但氯化氨、硫酸氨和尿素为氮源时，细菌几乎不生长即细菌含量较低，这可能是这三种氮源抑制了嗜水气单胞菌的生长，其抑制机制需进一步研究。

本试验采用正交设计与单因素方法相结合，筛选出不同培养条件对嗜水气单胞菌GZ1株生长状况的最优组合，使试验结果更科学、更完善[17]。