张晓峰，李超，鲁翠云，郑先虎，匡友谊，曹顶臣，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

提高生长速率可以缩短饲养时间，降低生产成本，增加养殖经济效益[1]，是水产育种的重要经济性状之一。生长速率性状是由多基因控制的数量性状[2,3]，这种性状基因型-表现型的关系可以被映射，以识别控制表型特征的基因组区域（即数量基因座位，QTL）[4]。目前，获得这些数量性状基因座位主要有两种途径：一是QTL定位分析；二是与性状相关联的分子标记的鉴定。QTL定位研究通过构建遗传连锁图谱来鉴定性状相关的特定染色体区段，即包含一个或若干个与性状相关的基因的DNA区域。性状相关分子标记鉴定根据表型和基因型的关系，通过一系列算法检测单个标记与QTL是否连锁来判断标记附近是否存在QTL，估计其重组率及遗传效应。如果标记与QTL存在连锁，则其位点或附近存在QTL[5]。鉴定与经济性状相关的QTL和相关标记，进行遗传改良，建立分子标记辅助育种技术，可以加快育种进程，提高育种效率。研究水产养殖动物经济性状相关的数量基因座位是水产分子育种领域研究的热点。

鲤Cyprinus carpio是淡水养殖中最常见的优良鱼类之一，在我国年产量349万t（FAO，2016），占世界鲤总产量的80%左右。我国是世界最大的鲤养殖国和消费国，对鲤生理、发育、免疫、遗传育种等开展了广泛而深入的研究。近二十年，不同基因组资源和遗传工具的开发加快了遗传改良和育种进程，包括数以万计微卫星标记和SNP标记的发掘[6,7]，不同版本的遗传连锁图谱的构建[8-10]，转录组测序[11]，基于SNP分型的芯片[12]，全基因组物理图谱的绘制[13]等。这些资源和工具的开发和利用使鲤数量性状QTL定位已经取得了很大的进展。自构建了鲤的首张遗传连锁图谱和鉴定出抗寒相关QTL以来[8]，相继利用多个鲤群体和家系构建了多个连锁图谱，开展了相关性状的QTL定位研究，如体质量[14-19]、体长[19-21]、食物转化率[22-25]、肌肉脂肪含量[26]和肌纤维性状[27]等性状，获得了多个家系的多个QTL定位结果。部分QTL定位结果已应用于鲤的育种实践，指导和建立了镜鲤的新品系，但对鲤生长速率性状QTL定位研究却很少[28]。

本研究利用553个分子标记构建了以良种祖父母后代培育出的镜鲤杂交F2群体的遗传连锁图谱，定位和分析了生长速率性状的QTL。同时采用相关标记扫描全基因组，采用标记回归方法确定与生长速率性状连锁的标记，在鲤全基因组中检索，找到了与生长相关的候选基因，为深入研究鲤生长性状相关的QTL和分子辅助育种（MAS）奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验用镜鲤采自黑龙江水产研究所松浦试验站，用杂交F2群体构建实验群体。F0（祖父母本）为早期由国家原种和良种审定委员会鉴定为良种的德国镜鲤选育系的后代，经微卫星分子标记检测遗传差异，构建F1（父母本）家系，F1代经两个冬季强化培育达2龄性成熟，杂交产生F2群体，池塘养殖2个月后，随机选取75尾F2个体，单个个体在水族箱中连续饲养3个月后测量体质量。

1.2 方法

1.2.1 生长速率的测定和计算

测量75尾实验鱼的初始体质量后，每尾鱼单独饲养在一个水族箱（60cm×45cm×45cm）中，养殖条件和饱食投喂一致。连续饲养3个月后，测定体质量。剔除极端表现型个体，剩余68个个体进行后续数据分析，实验鱼初始体质量为（5.05±1.32）g，结束时终体质量为（238.31±47.24）g。用如下公式计算：生长速率（GR）=（Wt-W0）/t，式中，W0和 Wt分别为初始和终末体质量（g），t为饲养天数（d）。

实验结束时，将实验鱼麻醉，尾静脉抽血1mL。采用QIAampDNA Blood Mini Kit血液提取试剂盒，参照标准流程提取血液样本的DNA。

1.2.2 基因型分析

采用PCR扩增法对所用微卫星标记进行多态性筛选，用筛选出的多态性标记检测群体的基因型。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为15μL，其中包括：1U Taq DNA聚合酶（Sangon）、1×PCRbuffer（10mmol/LTris-HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，0.01%gelatin，pH 8.3）、dNTPs各200 mmol/L、上下游引物各0.1mmol/L、100ng的模板DNA。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性 30s，退火温度 48～65℃ 30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物经135 V恒压、8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法显色后检测个体基因型。利用Illumina的SNP芯片平台进行SNP标记的基因分型。

1.2.3 遗传连锁图谱的构建和QTL分析以及单标记回归分析

选用在F2代个体中具有多态性且符合孟德尔分离比（P=0.05）的分子标记，利用 JoinMap 4.0[29]软件构建遗传连锁图谱。用MapQTL5.0[30]软件的区间作图法（Interval mapping）检测生长速率性状的QTL，通过置换实验（1000次重复）确定连锁群显著性水平阈值，取LOD2.8为QTL存在的阈值。应用MapQTL5.0软件进行标记回归分析，采用最大似然比法，以P＜0.01为显著性阈值检测单一分子标记与生长速率性状的连锁关系。

图1 镜鲤群体生长速率性状的正态分布Fig.1 The normal distribution of growth rate in the populations of mirror common carp

2 结果与分析

2.1 生长速率的测定及分析

根据我国《养殖鱼类种质检验》第三部分性状测定方法，测定和计算了实验群体的生长速率性状，测量值介于1.538～4.069 g/d，平均（2.592±0.506）g/d。运用SPSS11.5软件计算生长速率值的峰度（Kurtosis）为 1.665，偏度（Skewness）为 0.065（表1）。经正态分布检验，以P=0.05为显著性阈值，本实验的P为0.074，符合正态分布（图1），未发生偏分离，可以进行下一步的QTL定位研究（表1）。

2.2 遗传连锁图谱的构建

用600余对微卫星引物对基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测，各微卫星均获得了稳定、清晰的DNA条带，个体间呈不同程度的多态性。图2为微卫星HLJ365对68个试验个体的扩增结果，其中217个微卫星标记的多态性在10%以上。SNPs标记基因分型数据由基因芯片平台自带软件自动读取和分析，手工剔除错误分型标记后，剩余336个多态性SNPs标记。这两种标记共553个用于本研究中，用JoinMap4.0软件对这553个分子标记进行连锁分析，其中507个标记（微卫星标记186个，SNPs标记321个）共组成了50个连锁群，覆盖基因组总长度为2805.85cM，每个连锁群有10.1个标记，标记间平均距离为6.31cM。

表1 镜鲤生长速率正态分布检验Tab.1 Test of Gaussian distribution for growth rate in mirror common carp

图2 微卫星标记HLJ365在68个鲤样本的扩增结果Fig.2 Amplification of HLJ365 in 68 samples of mirror common carp

2.3 生长速率性状的QTL定位

采用MapQTL5.0软件的区间定位作图，通过置换检测（Permutation test）确定LOD=2.8为QTL存在与否的阈值。在各连锁群上对鲤生长速率性状进行区间作图定位分析中，共检测到10个与该性状相关的QTL区间，分别定位到鲤连锁图谱的LG1、LG5、LG12、LG35、LG36 和 LG47 等 6 个连锁群上，LOD介于2.80～5.64之间，解释表型变异介于19.2～55.2%之间（表2，图3）。其中，qGR35-1的LOD（5.64）最大和最高，可解释表型变异值（55.2%）。第35连锁群群（LG35）的 QTL最多，4个 QTL，解释表型变异分别为55.2%、19.2%、43.4%和43.9%；第1连锁群（LG1）次之，2个QTL，解释表型变异分别为54.5%和25.0%；其他连锁群上各有一个QTL。本研究中的10个生长速率性状QTL中，9个QTL的单个QTL解释表型变异率大于20%，为生长速率性状的主效QTL区间。

2.4 生长速率性状的单标记回归分析结果

利用MapQTL5.0软件中的Kruskal-Wallis检验对507个微卫星和SNP标记与生长速率性状进行标记回归分析，对鲤进行全基因组扫描。结果检测到16个标记与生长速率性状极显著相关（P＜0.01），解释表型变异范围为10.7%～34.7%，其中7个标记（HLJ365、SNP0137、SNP1167、SNP0167、SNP0919、SNP1041和HLJ401）解释表型变异达到20%以上（表3）。将这16个标记位点在鲤全基因组中进行检索，获得13个候选基因（其中SNP0137、SNP1096和SNP1167三个标记位于同一基因上，SNP0674和SNP0675位于同一基因上）。对所有基因的注释结果分别为：肌球蛋白家族（myosin-Va和myosin-VIIa）、生长激素调节的 TBC蛋白（growth hormone-regulated TBC protein）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase-like）、维生素K依赖性蛋白（vitamin K-dependent protein C-like）、胰腺α-淀粉酶（pancreatic alpha-amylase-like）、载脂蛋白（apolipo Eb-like）、核糖体蛋白（60S ribosomal protein L18）、视觉受体样蛋白（visual pigment-like receptor peropsin）、突触素抗体蛋白（synapsin-2-like）、胸腺细胞选择相关的高迁移率族盒蛋白（thymocyte selection-associated high mobilitygroup boxprotein）及两个未知蛋白（LOC109104831和LOC109098948）等。鉴定出这些候选功能基因为鲤生长相关的分子机理研究提供了信息。

图2 镜鲤生长速率性状QTL定位的LOD曲线Fig.3 Location of the QTL for growth rate in linkage group of the mirror common carp

表2 镜鲤生长速率性状的QTL 分析结果及遗传效应估计Tab.2 QTL detection for growth rate and estimation of genetic effects in mirror common carp

表3 镜鲤生长速率性状相关标记及候选基因Tab.3 Markers associated with growth rate and corresponding candidate genes in mirror common carp

3 讨论

鲤生长速率为多基因数量控制的经济性状，常与个体发育速度和年龄以及其他生活史性状相关[31,32]。本研究采用的鲤家系处于生长早期阶段，仅在2～5个月的年龄段内检测和估计了QTL效应，它们对生长后期和收获产量的有效性可能存在疑问。但以前的研究结果表明，鲤早期和后期的生长存在高度的遗传相关性[32,33]。这与Unwin等[34]对鲑的研究结果类似，即幼鱼早期生长速度也会影响最终的收获质量。这些研究结果暗示，生长相关的基因座在整个生长周期中持续影响生长。本研究获得的生长速率相关的基因座，如果在早期实施选择，对后期生长速率乃至收获产量同样有很大效果；加速早期选择对该性状的遗传改良作用，能缩短生长周期。

连锁分析和单标记回归分析是解析复杂数量性状的遗传基础的主要方法[5]。本研究采用这两种方法，共获得鲤生长速率相关的数量基因座位26个，分布在鲤基因组多个染色体上，符合多基因数量性状的特征。在获得的10个鲤生长速率相关的QTL中，有9个单个QTL对性状的贡献率大于20%，是生长速率性状的主效QTL区间，暗示对该性状具有重要作用。与Laghari等[28]的研究结果相比，本研究所有的QTL区间全为新发现的QTL。Laghari等2013年在荷包红鲤和大头鲤杂交F2群体的QTL定位研究中，共获得7个生长速率性状相关QTL，解释表型变异32.1%～34.4%之间。获得的16个极显著相关的分子标记，解释表型变异均在10%以上，其中单个标记贡献率大于20%的标记有7个，其中最大解释表型变异高达34.7%，说明这些标记对生长速率性状具有重要的作用，可作为分子标记辅助育种（MAS）的应用对象。纵观QTL定位分析和单标记回归分析结果，发现部分分析结果高度重合。其中单标记回归分析中位于第一连锁群（LG1）上的两个标记（HLJ365和SNP0137）分别位于qGR1-1和qGR1-2两个QTL区间内；位于第35连锁群（LG35）上的两个显著相关的标记SNP0919和SNP1041分别位于qGR35-2和qGR35-3上；位于LG47上的HLJ401也是位于qGR47-1区间上。这些检测结果的相互验证，证实本试验结果的可靠性。

为了获得控制生长速率性状相关的候选基因，本研究比对分析了与生长速率性状显著相关的16个标记所在的核酸序列在鲤全基因组物理图谱，确定了一批鲤生长速率相关的候选基因。由结果可知，16个标记对应13个编码基因。其中，肌球蛋白是肌肉细胞的重要组分，影响肌肉的生长速度和肌纤维的组成[35,36]。酶胰腺α-淀粉酶是一种重要的水解酶，参与碳水化合物的消化和吸收[37]。核糖体蛋白基不仅负责细胞内蛋白质的合成，还与细胞的生长、分化、胚胎发育等有关[38,39]。这些基因参与鱼体生长的具体生理生化即代谢过程还需进一步研究验证。

对生长率性状QTL的鉴定有助于更好地在遗传和细胞水平上了解生长；标记辅助育种可提高生长速度以获得更高的产量。本研究获得的对性状贡献较大的分子标记可直接应用于标记辅助选择育种，提高鲤生长速率，加快育种进程。但本研究样本量和标记数仍然相对有限，需要对更大样本的群体和更多标记作进一步的鉴定和验证分析。