曹志伟，陈红英

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100）

免疫球蛋白（Igs）由B淋巴细胞产生，在脊椎动物的适应性免疫反应中起重要作用。Ig分子由两条重链（IgH）和两条轻链（IgL）通过二硫键连接在一起，抗原结合位点位于IgH和IgL链的可变区。虽然鱼类的免疫系统比较原始，但是，硬骨鱼体内产生的Ig包括IgM[1]、IgD[2-4]和IgT/IgZ[5，6]。在机体内发挥功能的免疫球蛋白主要是IgM[7]，哺乳动物体内的IgM分子主要是以五聚体形式存在，而硬骨鱼的IgM分子主要为四聚体[8]。IgD在体液免疫中发挥重要作用[9，10]，IgT 在粘膜免疫应答中产生[11-13]。

抗体具有高特异性和高亲和力，特异性的抗体已经成为哺乳动物和脊椎动物免疫治疗及免疫学和诊断学的重要工具[14]。迄今已开发出多种针对鱼IgM的单克隆和多克隆抗体，如鲤Cyprinus carpio[15]、日本牙鲆Paralichthysolivaceus[16]和虹鳟Oncorhynchus mykiss[17]，用作这些鱼类的免疫学研究工具。这些抗体可以检测特定鱼的IgM，但是，单独开发用于检测每个物种免疫应答的抗体昂贵且耗时。为了降低成本和时间，本研究克隆和融合表达了鲫和虹鳟IgM的重链基因保守序列，用纯化的融合蛋白制备兔抗血清，获得了能同时用于特异性检测鲫和虹鳟IgM的多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

鲫购自陕西临潼区任留良友育种繁育场，虹鳟购自四川雅安贵特种水产经营部；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、透析袋（直径 27mm）、EL-TME显色试剂盒（EL-TMB Chromogenic Reagent kit）和抗生素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司；DL2000 DNAmarker购自 Vazyme；2×Pfu MasterMix，化学发光试剂盒和HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG购自康为世纪；大肠杆菌Top10（Escherichia coli Top10）、大肠杆菌 BL21（DE3）和质粒 pTriEx-1.1 皆由本实验室保存；2～3月龄新西兰大白兔购自西安交通大学实验动物中心；其他化学试剂为分析纯。

1.2 引物设计

在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载鲫和虹鳟的IgM重链基因序列，它们的GenBank序列号分别为GU563725和S63348，利用生物信息学分析基因的保守结构域，选定鲫IgM重链中的116～217位氨基酸序列和虹鳟 IgM重链中的135～235位氨基酸序列，优化氨基酸的密码子。将选定的鲫和虹鳟IgM重链保守区序列用Linker（Gly4-Ser）2连接，设计特异的引物（表 1），按照图1中的策略通过重叠PCR合成基因序列，将合成的基因命名为JY-HZ-IgM。

1.3 重组质粒pTriEx-JY-HZ-IgM的构建

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切处理质粒pTriEx-1.1和合成的JY-HZ-IgM基因片段，将双酶切产物切胶回收后置于20℃连接1h。连接产物pTriEx-JY-HZ-IgM转化到Top10大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB（含有氨苄霉素）的平板上，37℃过夜培养后，挑取单菌落进行菌落PCR检测，检测正确的菌落扩大培养后提取质粒进行双酶切鉴定和测序验证。

表1 引物的名称和序列Tab.1 Name and sequences of the primers

图1 JY-HZ-IgM片段合成策略Fig.1 Strategy for the JY-HZ-IgM fragment synthesis

1.4 融合蛋白JY-HZ-IgM的表达及可溶性分析

将重组质粒pTriEx-JY-HZ-IgM转化到BL21（DE3）感受态细胞中，然后将菌液涂在含有Amp的平板上，倒置，37℃过夜培养。挑取单菌落转接到5mL液体培养基中，37℃，250r/min摇菌。当菌液的OD600达0.7时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导6h。吸取1mL培养好的菌液到1.5mL离心管中，8000r/min离心5min，弃上清收集菌体，将5mL的菌体全部收集。离心管中加入1mL的20mMTris-HCl缓冲液清洗菌体，8000r/min离心5min，弃上清收集菌体，清洗3次。清洗完的菌体沉淀中加入1mL20 mMTris-HCl（pH 7.9）缓冲液,放置在超声波细胞粉碎机中破碎，然后8000r/min离心10min。收集上清和沉淀，沉淀用1mL的20mMTris-HCl缓冲液重悬，分别取样进行SDS-PAGE检测。

1.5 融合蛋白JY-HZ-IgM的纯化

包含pTriEx-JY-HZ-IgM质粒的大肠杆菌BL21（DE3），按照 1∶100 的比例转接到 100mL 新鲜培养基中，37℃，250r/min过夜培养。过夜培养菌液转移到50mL离心管中8000r/min离心15min，弃上清。菌体用20mMTris-HCl缓冲液清洗3次，加入20mL的Tris-HCl缓冲液重悬，然后用超声波细胞粉碎机破碎细胞，8000r/min离心30min，弃上清，收集沉淀。加入20mL8M尿素溶液，4℃放置12h充分溶解。然后按照His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，把纯化的蛋白溶液装入透析袋中，在4℃下依次放置在4M、2M、1M和0M尿素溶液中透析，最后把透析过的蛋白液进行SDS-PAGE检测。

1.6 融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清的制备

新购买的兔子在实验前先让其适应环境两周，每天按时喂养。选择A、B两只兔子采用皮下六点免疫。首次免疫每只兔子注射200μg融合蛋白JY-HZ-IgM，蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化。第2～4次每次注射融合蛋白JY-HZ-IgM 100μg，蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合，每次免疫间隔2周，一共免疫4次。免疫结束后一周心脏采血，37℃放置 1h，4℃静置过夜，1500r/min离心5min，收集血清，分装，-20℃保存备用。

1.7 兔抗JY-HZ-IgM血清效价的检测

以融合蛋白JY-HZ-IgM作为抗原，采用间接ELISA测定抗血清的效价。用包被液将抗原JY-HZ-IgM稀释到2μg/mL，然后把稀释好的抗原加到酶标板上，每孔50 μL，4℃过夜孵育。每孔加入200μLPBST放在摇床上清洗5min，重复清洗3次。每孔加入200μL封闭液，37℃放置2h。加入200μLPBST放在摇床上清洗5min，重复清洗3次。把抗血清按照1∶500、1∶2000、1∶8000、1∶32000、1 ∶128000、1∶512000、1∶2048000 和 1∶8192000 比例稀释，阴性血清1∶500稀释，然后按照顺序加入到酶标板中，37℃孵育2 h。加入200μL PBST放在摇床上清洗5min，重复清洗4次。加入100 μLHRP标记的羊抗兔 IgG（1∶10000 稀释），37℃孵育 1 h。加入 200 μLPBST放在摇床上清洗5min，重复清洗4次。每孔加入100μL显色液，避光反应10 min，加入50 μL终止反应液。把酶标板放到多功能微孔板检测仪检测OD450。若实验组OD450等于或大于阴性对照2.1倍，即可判定为阳性，阳性血清最大稀释倍数即为血清抗体的效价。

1.8 抗血清Western blot检测

心脏采血分离的血清作为一抗，分别与融合蛋白JY-HZ-IgM、鲫血清和虹鳟血清做Western blot分析，检测抗血清的结合效果。首先把融合蛋白JY-HZ-IgM、鲫血清和虹鳟血清通过SDS-PAGE分离。经转膜，封闭后加入心脏采血分离的血清作为一抗。洗膜，加入HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，洗膜。加入ECL显色液，避光反应3min，最后放在化学发光成像系统（ChemiDocXRS+）中检测。

2 结果与分析

2.1 JY-HZ-IgM序列合成

分别选取鲫和虹鳟IgM重链保守区一个保守的结构域设计引物，通过重叠PCR的方法克隆目的基因。将合成的片段JY-HZ-IgM用1%的琼脂糖电泳凝胶检测，预期片段大小为710 bp，检测结果（图2A）与预期相符，表明成功合成了JY-HZ-IgM片段。

2.2 重组质粒pTriEx-JY-HZ-IgM检测

平板上单菌落PCR检测结果表明（图2B），扩增片段大小和预期相符（预期为710 bp）。提取质粒后进一步通过双酶切检测，酶切结果大小与预期相符（图2C），最后送到北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果正确，表明成功构建了pTriEx-JY-HZIgM质粒。

图2 重组质粒的构建及鉴定Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmid

2.3 融合蛋白JY-HZ-IgM的表达检测

将构建的重组质粒pTriEx-JY-HZ-IgM转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，融合蛋白JY-HZ-IgM表达的可溶性分析结果见图3。由图3可知，表达的融合蛋白在上清中含量很少，大部分都在沉淀中以包涵体形式存在。包涵体沉淀用8M尿素溶解后，用His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得融合蛋白JY-HZ-IgM（图4），透析去除尿素后用分光光度计检测可溶性的融合蛋白浓度为450μg/mL，纯度在90%以上，达到后续实验要求。

2.4 融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清效价的测定

图3 SDS-PAGE检测融合蛋白JY-HZ-IgM表达Fig.3 SDS-PAGE detection of the fusion protein JY-HZIgM expression

图4 纯化的JY-HZ-IgM蛋白检测Fig.4 Detection of purified JY-HZ-IgM protein

图5 抗血清效价检测Fig.5 Detection of antiserumtiter

融合蛋白JY-HZ-IgM抗血清效价的间接ELISA检测结果见图5。由图5可知，A兔和B兔抗血清的效价都很好，B兔抗血清的效价略高于A兔。其中A兔制备的抗血清稀释2048000倍时OD450仍大于免疫前阴性血清的2.1倍，判定为阳性。B兔制备的抗血清稀释8192000倍时OD450仍大于阴性血清的2.1倍，判定为阳性，表明制作的兔抗JY-HZ-IgM血清效价高于1∶2048000。

2.5 Western blot检测抗血清的特异性

Western blot检测制备的兔抗JY-HZ-IgM血清与JY-HZ-IgM蛋白特异性结合的结果见图6。由图6可知：蛋白条带与预期大小（25.3kDa）相符，制备的抗血清可以和JY-HZ-IgM特异结合（图6，泳道1）。制备的抗血清与天然鲫血清、虹鳟血清进行Western blot检测，鲫的IgM单条重链约70kDa，天然（非还原）状态下与轻链结合，以四聚体的状态存在。还原和非还原状态的Western blot检测也表明，制备的抗血清可以识别还原和非还原状态的鲫IgM（图6，泳道2和3）。虹鳟IgM重链的理论大小为64.9 kDa，还原和非还原条件下Western blot检测结果与预期相符（图6，泳道4和5）。以上结果表明，制备的兔抗JY-HZ-IgM血清不仅能够与融合蛋白JY-HZ-IgM特异性结合，还可以识别天然的鲫和虹鳟的IgM，因此制备的兔抗JY-HZ-IgM血清可以用来检测鲫和虹鳟血清中的IgM。

图6 用抗血清检测鲫和虹鳟IgMFig.6 Detection of IgM of crucian carp and rainbow trout by antisera

3 讨论

我国的水产养殖历史悠久，近年来水产品的产量持续稳定增长，其中鲫和虹鳟的养殖占有重要地位。但是，随着密度增大，水质不断恶化，养殖中细菌病和病毒病频发。硬骨鱼类的IgM是体内含量最多的免疫球蛋白，在体液免疫反应中发挥核心作用[18]，在粘膜组织中具有较高的mRNA和蛋白水平。在寄生虫、病毒或者细菌刺激鱼体时，研究鱼体内的免疫球蛋白M的变化规律有助于改进疾病的预防和治疗措施。因此，研究鱼类免疫球蛋白[19]及抗IgM的抗体的制备，可为鱼类的免疫学研究提供检测材料。

为了检测鲫和虹鳟感染病毒后血清中IgM的变化量，本研究从NCBI获取鲫和虹鳟IgM的重链序列，利用生物信息学分析序列的保守结构域，人工合成鲫和虹鳟IgM的重链保守序列JY-HZ-IgM。把合成的JY-HZ-IgM片段克隆到pTriEx-1.1载体上进行原核表达，结果融合蛋白JY-HZ-IgM大部分以包涵体的形式存在。尿素使蛋白变性后用His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，透析复性得到可溶的融合蛋白JY-HZ-IgM，浓度达到450μg/mL。本研究以纯化的融合蛋白JY-HZ-IgM作为抗原制备了兔抗JY-HZ-IgM血清，利用间接ELISA测定了抗血清的效价，阳性血清稀释2048000倍时OD450仍为阴性血清的2.1倍。为了检测制备的抗血清的结合特异性，分别与融合蛋白JY-HZ-IgM、天然鲫血清和虹鳟血清进行了Western blot检测。据报道，硬骨鱼的IgM重链为60～81kDa[20，21]，本实验中Western blot检测的鲫和虹鳟IgM的大小相符，表明制备的抗血清可以与JY-HZ-IgM、天然鲫和虹鳟血清中的IgM特异性结合。因此，本实验中制备的兔抗JY-HZ-IgM血清可以用于检测鲫和虹鳟的IgM在不同条件下表达量。

综上所述，本研究成功合成了JY-HZ-IgM基因片段，表达、纯化了鲫和虹鳟IgM重链的保守蛋白，制备了高效价的抗JY-HZ-IgM的兔抗血清，为进一步研究鲫和虹鳟IgM在不同条件下的表达规律和机制奠定了基础。