廉正义，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋，刘小雪，谭静

（天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis是我国名贵的海水鱼类之一[1]。随着工厂化养殖发展，舌鳎皮肤溃烂、腹水症等病害频繁发生[2]。研究表明，鱼类皮肤黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白、补体、凝集素和溶菌酶等组成[3]。其中，黏蛋白是一种多功能糖蛋白，主要分为膜结合型（即细胞表面黏蛋白）和分泌型两种类型，已报道大约有20种黏蛋白，在鱼类抗感染中具有重要作用[4]。对人和哺乳动物研究表明：黏蛋白与疾病免疫密切相关，已受到国内外学者广泛关注[5-7]。目前发现膜结合型黏蛋白MUC1、MUC3、MUC13等基因主要在胃肠道黏膜上皮细胞表达，参与细胞信号传导、黏附、生长及免疫调节[5,7]。Shoe-maker和LaFrentz等[8]报道，鱼类运输胁迫可导致皮肤黏液及黏蛋白减少，引起继发性细菌感染。迄今为止，在金头鲷Sparus aurata等鱼类中也发现了膜结合型黏蛋白，包括MUC1、MUC13和MUC18等[9]。但是，关于半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因克隆表达研究，目前尚未见有文献报道[10-12]。

本研究采用PCR方法扩增和克隆了半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因，利用生物信息学方法对预测分析基因蛋白序列的结构域，为进一步研究鱼类黏蛋白在抗病免疫应答中的功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验鱼

健康半滑舌鳎体质量约为100g，购自天津市某水产养殖公司，经MS-222麻醉后取皮肤组织保存于液氮中备用。

1.1.2 试剂

Trizol试剂、DEPC处理水、焦碳酸二乙酯DEPC试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector购自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR扩增试剂均购自上海捷瑞生物工程公司，RNA反转录试剂盒购自ThermoScientific公司，甲磺酸三卡因MS-222购自北京格林科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的制备

参照薛春雨等[12]，采用Trizol法提取半滑舌鳎皮肤总RNA，按照RevertAid第一链cDNA合成试剂盒的操作步骤，将RNA反转录为cDNA，-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计与合成

参考半滑舌鳎基因组黏蛋白基因序列（登录号:XM025055230）设计2对黏蛋白特异性引物用于PCR扩增，引物由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

1.2.3 半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因克隆

以皮肤组织cDNA为模板，采用RT-PCR方法扩增黏蛋白CsMUC18基因序列。PCR扩增体系为25μL，包括cDNA模板2μL、上下游引物各1μL、Master Mix10μL和ddH2O11μL。PCR循环程序为：95℃ 2min，95℃ 45s，56℃或 59℃ 45s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段；胶回收产物与pMD18-T载体进行连接，进一步转化到DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.4 基因序列及其结构分析

参照李雪等[13]描述方法进行，采用ProtParam、TMHMM（https://www.expasy.org/）等在线分析软件分别预测分析黏蛋白理化性质及结构，MEGA7.0软件邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因的PCR扩增及理化特性分析

图1 黏蛋白CsMUC18基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of the CsMUC18 gene

表1 黏蛋白CsMUC18 PCR扩增的引物序列Tab.1 Primer sequences of the CsMUC18 gene

图2 半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因上下游引物测序图谱和推导氨基酸序列Fig.2 Sequencing of CsMUC18 gene primers and deduced amino acids

图3 黏蛋白CsMUC18的信号肽预测图、跨膜区、抗原指数、蛋白亲水性及表面可能性分析Fig.3 Signal peptide,transmembrane domain,antigenic index,prediction of hydrophilicity and surface probability of CsMUC18

采用RT-PCR方法扩增半滑舌鳎皮肤黏蛋白CsMUC18基因片段，分别获得特异性片段长度大小为1000bp和1200bp左右目的条带，与预期片段大小一致（图1），测序获得长度为870bp和1202bp的两条序列，经拼接基因全长为1934bp，可编码635aa，引物序列见图2。预测该黏蛋白CsMUC18分子量约为69.38kD、等电点为4.90，1个信号肽序列MALRDSACLLLGLLLLCHTWGAWA（1～24aa），包含膜内区（583～635aa）、跨膜区（560～582aa）和膜外区（1～559aa），以及 7 个主要抗原表位区（67～79、172～177、218～225、552～558、593～605、613～618 和628～635aa）（图 3）。CsMUC18 蛋白修饰位点预测结果显示：含有8个糖基化位点N-{P}-[ST]-{P}（PS00001）主要有 Asn96/177/247/308/333/393/477/490，主要有 1 个蛋白激酶 CK2磷酸化位点 [ST]-x（2）-[DE]（PS00006）为 Ser156、5 个蛋白激酶 C（PKC）磷酸化位点[ST]-x-[RK]（PS00005）为Ser208/263/496/593/603。

2.2 CsMUC18基因序列比对及进化树分析

采用Blastp检索比较黏蛋白基因蛋白序列的同源性，结果显示CsMUC18与大菱鲆、金头鲷、斑马鱼和人黏蛋白MUC18相似性分别为61.31%、58.38%、41.09%和32.69%。选取大菱鲆、金头鲷、斑马鱼和人的黏蛋白MUC18等氨基酸序列进行比对，结果显示 CsMUC18 在 277～303aa、445～481aa位置存在2个高变区。Motifscan检索发现：CsMUC18属于免疫球蛋白家族，其中发现5个免疫球蛋白结构域（25～138、146～247、253～331、342～421 和 428～498aa），依次为免疫球蛋白V-set区（Ig superfamily V-set,pfam07686），免疫球蛋白超家族（Igsuperfamily,cl11960）、类免疫球蛋白（Ig superfamily IG-like,smart 00410）、免疫球蛋白超家族2（Ig superfamily IG-2,pfam13895）、免疫球蛋白 I区（I-set superfamily,cl28434）（图4）。从NCBI数据库下载半滑舌鳎、大菱鲆、金头鲷、斑马鱼、鼠、牛和人等9个物种的黏蛋白构建系统发育进化树。该进化树分析显示：MUC1、MUC13和MUC18等属于膜结合型黏蛋白，MUC2、MUC5AC和MUC19等属于分泌型黏蛋白，其中CsMUC18与大菱鲆、金头鲷和斑马鱼等鱼类膜结合型黏蛋白亲缘关系最近，自然聚为一支，与人、鼠、牛的黏蛋白亲缘关系较近；但是与半滑舌鳎、斑马鱼、人和鼠等物种的分泌型黏蛋白亲缘关系相对较远，聚为另一支（图5）。

图4 黏蛋白CsMUC18氨基酸序列比对与结构域预测Fig.4 Multiple alignment and structural domain prediction of deduced amino acid sequence of the CsMUC18

2.3 半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18结构预测

蛋白质二级结构预测表明：黏蛋白CsMUC18以β折叠为主，其中包含1个由α螺旋构成（568～576aa）的跨膜区（图 6A）；三级结构主要由 6个蛋白亚基组成，其中包括细胞膜外区域由5个免疫球蛋白亚基以及细胞膜内区域1个蛋白亚基组成，与其二级结构预测结果基本一致（图6B）。

图5 不同物种黏蛋白与半滑舌鳎CsMUC18氨基酸序列进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the mucin amino acids sequences in CsMUC18 between semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis and different species

3 讨论

半滑舌鳎是一种海水底栖鱼类，其皮肤、鳃等黏膜组织损伤易导致病原感染[14]。鱼类皮肤黏液是阻止病原微生物入侵的第一道防线，其黏膜免疫应答对病原体的防御尤其重要[15]。黏蛋白是黏液的主要成分，分为膜结合型和分泌型两种类型[4,16]。Adamek等[17]分析了病毒诱导鲤Cyprinus carpio黏蛋白基因在皮肤、鳃和肠道黏膜组织中的表达，表明病毒感染后鳃和肠道黏蛋白基因mRNA表达水平下降，往往造成黏膜组织受损感染加重。Perez-Sanchez等[7]报道，膜结合型黏蛋白MUC18在鱼类皮肤和鳃中表达丰富，具有免疫防御、促进机体发育和调节渗透压平衡等多种功能。研究证实，人黏蛋白MUC18表达水平异常变化与免疫相关疾病发生有关[18,19]。Bai等[20]报道，在人肿瘤组织中黏蛋白MUC18基因表达水平显著性降低，这与肿瘤细胞增殖扩散有关。研究表明，人呼吸道上皮细胞表面黏蛋白MUC1参与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa黏附素的黏附结合过程，唾液黏蛋白对口腔及牙齿健康有保护作用，认为在口腔干燥症和龋病防治有应用前景[21,22]。

迄今，针对鱼类皮肤黏蛋白基因克隆表达的研究相对较少[7,11,12]。关于半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息学分析，目前未见有报道。Perez-Sanchez等[7]对金头鲷膜结合型黏蛋白MUC13和MUC18研究表明，MUC18在鳃和皮肤中表达丰富，属于免疫球蛋白家族基因，含有5个免疫球蛋白结构域。本研究通过生物信息学预测发现，半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18主要包含免疫球蛋白V-set区（Ig superfamily V-set），Ig 超家族（Ig superfamily）、类 Ig（Ig-like）、Ig超家族 2（Ig-2）和免疫球蛋白 I-set区（I-set superfamily）等免疫球蛋白超家族结构域，推测CsMUC18为免疫球蛋白家族基因，这与报道的其他鱼类黏蛋白MUC18结果一致[7]。本文选择黏蛋白MUC1、MUC13和MUC18等22个黏蛋白序列构建系统发育树，结果显示半滑舌鳎CsMUC18属于膜结合型黏蛋白，与大菱鲆、金头鲷黏蛋白MUC18亲缘关系较近，关于MUC18的生理及免疫功能需要进一步研究。

本研究对半滑舌鳎黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息学分析，预测黏蛋白CsMUC18含有1个信号肽、5个免疫球蛋白结构域及1个跨膜区，为今后深入研究海水鱼类黏蛋白的功能奠定基础。

图6 黏蛋白CsMUC18的结构预测Fig.6 Structure prediction of CsMUC18