方聪聪 毛善平 董慧敏 刘宝辉 王舜



线粒体自噬与中枢神经系统疾病关系的研究进展

方聪聪 毛善平 董慧敏 刘宝辉 王舜

1 线粒体自噬

1.1 概念

细胞自噬(Autophagy)是真核细胞中进化上高度保守的、用于降解和回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程。根据底物进入溶酶体内的途径不同可将自噬分为 3 种类型：微自噬 (microautophagy)、分子伴侣介导的自噬 (chaperonemediatedautophagy， CMA)、巨自噬 (macroautophagy)[1]。大多数情况下所指的自噬即为巨自噬或大自噬。巨(大)自噬可以分为选择性和非选择性，之前的研究认为自噬对降解底物没有选择性，最近的研究表明自噬体可以特异地包裹线粒体，并且通过自噬机制将其降解掉。这一选择性降解过程被称为线粒体自噬[2]。细胞自噬受体如p62等的发现也表明细胞自噬同样具有很强的选择性，这一类由细胞自噬受体介导的细胞自噬被称为细胞选择性自噬(Selective autophagy)。目前研究较多的选择性自噬还包括Cvt(cytoplasm-to．vacuole transport)途径、内质网自噬、过氧化物酶体自噬、核糖体自噬和脂类自噬。选择性自噬途径最主要的特征是有自噬受体(autophagyreceptor)的参与，它们对自噬底物有特异性的识别和运输的作用，从而靶向自噬底物的降解，赋予依赖自噬降解的物质处于极其精密的动态调控之下。这些自噬受体都含有保守的LIR(LC3-interacting region) domain，这一重要结构域可以与自噬小体上的Atg8家族的分子结合，从而具有介导自噬降解的功能[3-4]。

线粒体自噬是 Lemasters[5]在2005 年首次提出的，主要是指在 ROS、营养缺乏、细胞衰老等刺激下细胞内的线粒体发生去极化损伤，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中，并与溶酶体(lysosome) 融合，从而完成损伤线粒体的降解，维持细胞内环境的稳定。线粒体自噬是研究较多的一种特异性自噬，它调节细胞对多余或功能受损的线粒体进行选择性的清除。

1.2 线粒体自噬相关蛋白

1.2.1 线粒体融合蛋白1(mitofusin 1，Mfn1) 、2(mitofusin 2，Mfn2) 和显性视神经萎缩蛋白1(optic dominant atrophy 1，OPA1) 是线粒体融合所需的蛋白，而线粒体分裂蛋白(dynamin-related protein，Drp1) 和分裂蛋白(fission1，Fis1) 为线粒体分裂所需的蛋白[6]。研究提示，PINK1 和Parkin 通过调节线粒体分裂和融合状态，使线粒体分裂产生受损线粒体碎片后被选择性自噬降解[7]。

1.2.2 经典自噬相关蛋白 主要有LC3和Beclin1；线粒体自噬的发生依赖上游线粒体自噬蛋白的募集。自噬相关蛋白LC3是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因(autopharmacy-related gene, ATGB)[8]的同源物，靶向定位于自噬体膜，参与自噬的形成，分为I型和II型[8]。当自噬发生时I型经泛素样加工修饰与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成II型LC3, LC3-II蛋白结合并始终位于胞内自噬体膜上，其含量与自噬泡数量成正比，被认为是自噬体的标志分子[9]，研究中所测LC3水平均为LC3-II。因此，LC3-II也被广泛应用于自噬标记物来研究哺乳动物中自噬的表达。自噬相关蛋白Beclinl 1是哺乳动物中首个被发现的具有调节细胞自吞噬作用的抑癌基因，定位于人染色体17q21，大约有150 kb，Beclin 1是自噬起始的重要调节因子[10]。Beclin 1本身并没有酶活性，在多种重要的细胞分子如HIF- 1、Bcl -2、mTOR、 Bcl-xl、JNK Ambra 1等的参与下通过与磷脂酞肌醇3激酶(PIK3)结合形成ULK 1复合物来启动自噬[11]。

1.2.3 在哺乳动物中已经得到证实的线粒体的选择性自噬受体蛋白或者受体相关因子包括NIX/BNIP3L，FUNDC1，PINK1/Parkin，and BCL2L13 (Bcl-rambo)等[12-15]，自噬受体蛋白具有两个共同功能性结构域：跨膜结构域和一个LIR模体。其选择性自噬过程为自噬受体蛋白通过跨膜结构域固定于线粒体外膜上，通过LIR靶向LC3，进而通过自噬途径降解。Orvedahl等人使用全基因组siRNA筛选的方法发现了一个新型的选择性自噬因子SMURF1，它是一种HECT为主的泛素连接酶，靶向某些胞质蛋白[16]，可以在受损线粒体募集，促进线粒体自噬的发生[17]。在SMURF1缺陷的小鼠的心、脑及肝脏中观察到线粒体肿胀、破碎及异常线粒体嵴结构等。然而SMURF1作为线粒体自噬受体的功能以及SMURF1和LC3的相互作用仍不清楚。

2 线粒体自噬的分子机制

保持线粒体健康的状态和稳定的数量对于细胞维持正常的功能有着重要的意义。目前，线粒体自噬被认为是一种重要的线粒体质量与数量调控机制，对维持线粒体功能稳定性相当重要[18-22]。目前，虽然线粒体自噬得到广泛的研究，但是对于线粒体自噬调控机制的研究还进行的很少。当细胞处于饥饿或缺氧条件时会诱导细胞的线粒体自噬，然而不同条件下引起线粒体自噬的机制并不相同。低氧条件是一种经典的诱导线粒体自噬的刺激[23]，用低氧混合气体处理细胞，不管线粒体外膜蛋白TOM20还是内膜蛋白TIM23都被降解，同时LC3-II水平升高，表明低氧可以引起强烈的线粒体自噬。哺乳动物细胞中大自噬是最具特征的自噬，饥饿是介导大自噬的最强刺激[24-26]。Lemasters和colleagues在饥饿诱导自噬的研究中发现，线粒体可以被包裹到表面带有自噬体标志物LC3的小泡中，这个过程大约在5 min内完成。早期的研究已经证实，细胞通过线粒体自噬可以调整细胞内部线粒体的数量，使之与代谢需求相匹配，同时清除功能受损的线粒体以完成对线粒体的质量控制[27-28]。下面介绍3种线粒体选择性自噬的调控机制。

2.1 PINK1-Parkin 信号通路

Parkin是一个E3泛素连接酶，存在于细胞浆中[29]。Pink1是一个丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种蛋白激酶，位于线粒体外膜上，位于Parkin的上游发挥作用。Parkin没有线粒体定位序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)[30]。目前的研究认为Pink1能磷酸化Parkin，促进Parkin由胞浆到线粒体的转位[31]。PINK1 可能被表达并转运至所有线粒体上，但是在健康的线粒体上会被迅速降解掉，而受损的线粒体由于蛋白水解酶的活性被抑制，从而使PINK1得到有效的积累，PINK1 募集Parkin 定位在受损的线粒体，加强了E3 泛素连接酶的活性，可以使线粒体基质蛋白泛素化[32-33]，进而促进线粒体自噬发生(图1)。譬如P62可以在泛素化的线粒体基质上积累[32-33]，进而与LC3 结合，介导泛素化的底物进入自噬体。细胞内的许多成分都可成为 Parkin 的泛素化底物。目前，在哺乳动物细胞线粒体已明确了3种parkin的底物[34]：线粒体融合蛋白(Mitofusin, Mfn)1，Mfn2[35-36]和电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC 1)[37]。这3种底物都镶嵌于线粒体外膜中。Parkin被募集到线粒体上后能通过介导以上泛素化底物的泛素化来参与线粒体的自噬。VDAC 1是线粒体通透性转换孔的一个组成部分，VDAC 1的泛素化可能阻止细胞质中促调亡因子通过线粒体通透性转换孔释放，可能是parkin介导的线粒体自噬所必须的[31]，但也有人认为与其无关[33]。

最近的研究表明, Parkin和Pink1蛋白参与了膜电位降低引起的线粒体自噬的发生[38-39]。Shoushui[40]等的研究也表明线粒体钙单向转运体抑制剂可以通过调节线粒体膜电位来抑制线粒体过度自噬，从而在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。体外培养的肝细胞在饥饿的情况下能观察到快速的线粒体被降解的情况，而用线粒体MPT孔的抑制剂CsA能够在抑制膜电位降低的同时抑制线粒体自噬的发生[41]。所以，线粒体膜电位的降低可以诱导PINK1-Parkin 信号通路，从而介导线粒体自噬的发生。

PINK1激活Parkin的过程包括PINK1磷酸化Parkin的Ub1结构域S65和磷酸化泛素上一个类似S65位点(PUb)[42-44]，Ub1的磷酸化会增加Pub对Parkin的亲和力，进一步稳定活化的Parkin[45]。如果PINK1磷酸化泛素S65位点以外的其他位点如pUb(S20) or pUb(S57)均不能激活Parkin[46]。

因Parkin 是一种泛素连接酶，故PINK1-Parkin 信号通路介导线粒体自噬的发生不仅依赖自噬-溶酶体的活性，还依赖UPS(E3泛素连接酶)Parkin传递泛素至底物的过程。因此，去泛素化酶(DUBs)就有望成为线粒体自噬的阻滞剂。若用去泛素酶DUBs(USP)干预可能就会导致泛素-蛋白酶体循环障碍，底物泛素化障碍，不能募集线粒体自噬相关蛋白，进而导致线粒体自噬的下调。亦有报道去泛素化酶家族DUBs中USP15[47],USP30[48]和USP35[49]直接去泛素化Parkin的底物，下调线粒体自噬。而USP8直接靶向Parkin本身，反而有助于线粒体自噬的发生[50]，然而USP8上调线粒体自噬是通过去泛素化Parkin还是稳定内源性Parkin仍不清楚。

2.2 线粒体自噬蛋白受体的磷酸化

通过调节线粒体膜上自噬受体蛋白的磷酸化水平是控制线粒体自噬的重要途径。最新的研究表明，在哺乳动物细胞中线粒体自噬受体蛋白FUNDCl参与了缺氧介导的线粒体自噬[23]。其中，FUNDC1的磷酸化在线粒体自噬调控中发挥了关键作用。FUNDC1是一个三次跨膜蛋白，定位在线粒体外膜上。在正常情况下FUNDCl的18位酪氨酸可以被Src蛋白激酶磷酸化，从而降低与LC3的结合能力。在缺氧条件下Src蛋白激酶的活性会受到抑制，使得FUNDCl去磷酸化，FUNDCl和LC3相互作用增强，从而介导线粒体自噬的发生。大量的研究证明，Bnip3和Nix与LC3同样有直接的相互作用。它们与FUNDCl一起在缺氧介导的哺乳动物细胞线粒体自噬中发挥着重要作用[51-52]。

FUNDC1作为新的线粒体自噬受体的发现使我们有机会进一步研究哺乳动物细胞线粒体自噬的调控机制。进一步研究FUNDC1介导的线粒体自噬与Parkin介导的线粒体自噬的相互关系及FUNDC1的生理功能及其与疾病发生的关系显得十分必要。

2.3 Bnip3/Nix介导的线粒体自噬

Bnip3除了最初发现在细胞死亡中发挥着重要的作用，同时它也是细胞自噬乃至线粒体自噬过程中的重要参与者。Bnip3在缺血再灌注损伤的情况下会激活自噬反应，后者清除损伤的线粒体，可能会起到一种保护作用[53]。最近的研究表明，Bnip3和自噬的关键蛋白LC3有直接的相互作用，介导了线粒体自噬的发生[54]。Nix和Bnip3在蛋白序列上有56%的同源性，并且在人的很多组织中广泛表达。Nix在红细胞成熟过程中参与线粒体自噬被广泛研究。有学者发现Nix被诱导也可引起线粒体膜电位下降，从而激活自噬机制，引起线粒体被选择性地清除[55]。也有研究表明，Nix可能是一个线粒体自噬的直接受体，它能够和LC3蛋白直接结合，并募集LC3到损伤的线粒体上而引起线粒体自噬的发生[56](图1)。

3 线粒体自噬与中枢神经系统疾病的关系

线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的自噬过程，在调节细胞内线粒体数量和维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用，与诸多生理和病理学过程密切相关。线粒体自噬对于生理和病理状态下神经细胞的功能维持十分重要。其中，线粒体自噬与神经系统退行性疾病的关系已经得到广泛研究。

图1 经典自噬与线粒体自噬的主要相关信号通路 PINK1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；Parkin为泛素连接酶；Beclin1为自噬关键蛋白；LC3为自噬特异性蛋白；VADC1为阴离子选择性通道蛋白；FUNDCl为线粒体自噬受体分子；Binp3为凋亡相关基因；Nix为促凋亡蛋白；Ub为泛素；Drp1为线粒体分裂蛋白；p53为肿瘤抑制因子；Bcl⁃2为抗凋亡蛋白；mTOR为雷帕霉素靶蛋白

3.1 线粒体自噬与帕金森病

大量研究表明线粒体损伤是PD的一个重要因素[57]。在老年个体多巴胺能神经元mtDNA缺失很常见，而在PD患者这种现象更为严重和普遍。PD患者的黑质和杏仁核线粒体自噬功能是有缺陷的[58]；线粒体复合物I抑制剂可导致PD。多个PD相关的致病基因对线粒体功能有影响。帕金森病相关基因编码蛋白(PINK1和PARKIN 基因分别表达PINK1 蛋白和PARKIN 蛋白)参与调控线粒体自噬，二者协同调节细胞内线粒体质量控制通路(线粒体自噬)以维护线粒体质量和能量生成。 其中，PINK1 大量表达于黑质，存在于线粒体内(主要定位于线粒体内侧膜，少量定位于内外侧膜间腔)或者表面[59]，参与线粒体代谢、氧化应激、氧化磷酸化、钙稳态、线粒体动力和异常蛋白质的蛋白酶体降解过程[60]。而PARKIN 主要选择性聚集于陈旧线粒体的外侧膜，将泛素联结于待降解蛋白并参与调节自噬小体吞噬、降解此线粒体。研究发现线粒体自噬缺陷与帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的发生有关。对帕金森病模型的研究发现，细胞中存在增大和水肿的线粒体[61]，表明帕金森病的发病与线粒体清除失败相关。PINK1、PARKIN 突变的发生通过损害募集线粒体自噬蛋白于陈旧线粒体、陈旧线粒体分离及陈旧线粒体转运这三大过程而导致受损线粒体的堆积，进而促进神经元退行性变的发生及最终帕金森病的形成(图2)。

在认识到线粒体自噬参与帕金森病病理机制的同时，我们也应该注意到，与自噬相似，线粒体自噬似乎也存在着稳态，即线粒体自噬的缺失或过度活化都会对中枢神经系统造成损害，而适当的保持稳态的线粒体自噬对于维持中枢神经系统正常的功能活动至关重要。

图2 PINK1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；Parkin为泛素连接酶；LC3为自噬特异性蛋白；VADC1为阴离子选择性通道蛋白；Ub为泛素；Miro为线粒体外膜锚定蛋白；Milton为结合蛋白；MFN为线粒体融合蛋白；KIF5为驱动蛋白；Drp1为线粒体分裂蛋白 (1)PINK1蛋白募集PARKIN由胞浆定位于陈旧线粒体的外膜[39]，并将线粒体膜上的VDAC1(parkin介导的Lys27泛素化和P62介导的自噬的作用靶点[37])泛素化，导致泛素连接调节蛋白p62集聚在线粒体，进而与自噬蛋白LC3家族直接接合，使得被分离出来的老化受损的线粒体通过自噬被清除[37]；(2)PINK1募集PARKIN从胞浆移向受损线粒体外层膜，促进线粒体融合蛋白(MFN，线粒体表面的大GTP酶，重要的促线粒体融合因子)发生泛素化，将受损线粒体单独分离出来，并最终启动自噬；(3)帕金森病患者的线粒体转运出现缺陷。线粒体通过线粒体外膜锚定蛋白Miro和结合蛋白Milton被绑定在微管上形成微管线粒体转移复合体，其中Miro固定在线粒体外膜并与Milton结合，Milton与KIF5(驱动蛋白)结合，而PINK1蛋白能与此复合体相互作用，且发现Miro为PINK1下游作用物(PINK1基因沉默后线粒体裂解通过Miro的过表达而被抑制)。

3.2 线粒体自噬与缺血性脑血管病

缺血性脑血管病尤其是急性期涉及线粒体的广泛损伤，包括线粒体超微结构的改变、膜流动性的改变、膜电位的改变、能量泵的改变及自由基的改变。线粒体损伤后其通透转化孔(mPTP)开放，线粒体肿胀、破裂，释放细胞色素酶C及凋亡因子，启动凋亡信号，造成神经细胞不可逆性死亡。临床上很多药物如丁苯酞、丹参等就是通过减少线粒体损伤来发挥脑保护作用。诸多研究都已经发现脑缺血中有自噬-溶酶体的激活。自噬在缺血性脑损伤过程中发挥保护作用的机制尚不完全明确。线粒体自噬可能在其中发挥了关键作用。有研究发现脑缺血/复灌过程可以诱导缺血脑区神经元发生线粒体自噬, 抑制复灌过程中的线粒体自噬则加重缺血导致的细胞色素C释放、神经元凋亡及脑组织损伤，提示线粒体自噬是一种脑缺血/复灌病理过程中重要的内源性保护机制[62]。在缺血性脑损伤过程中基因沉默Parkin 可干扰OGD(oxygen-glucose deprivation)复灌模型诱导的线粒体自噬，并进一步加重神经元损伤，提示Parkin介导了该过程中的线粒体自噬[62](图3)。Parkin 是否是缺血/复灌诱导线粒体自噬的唯一机制，通过调控Parkin 能否逆转缺血性脑损伤等问题仍未明确，值得进一步深入研究。李强、孙晓江等[63]的研究利用 MCAO模型，通过电镜、免疫组化western-blot等技术首次证实了线粒体自噬在 MCAO 模型中的表达规律，推断上调线粒体自噬可能会有利于减轻缺血再灌注所致的神经细胞损伤。线粒体作为一种重要的细胞器对缺血状态下的神经元命运发挥了至关重要的作用[64-65]。

有学者利用体内、外缺血性脑损伤模型，比较了长时程缺血及缺血/复灌两种病理条件下自噬对脑损伤的作用，结果发现自噬在长时程缺血模型中发挥了神经损伤作用，而在缺血/复灌模型中通过抑制细胞凋亡发挥了神经保护作用[62]。 这些研究提示脑缺血过程中自噬的复杂性，其作用可能受缺血的时程、严重程度及脑区部位等因素调控，也揭示了简单利用自噬抑制剂作为抗脑缺血药物的潜在风险。

图3 线粒体自噬与缺血性脑血管病 Ψm为膜电位；mPTP为线粒体通透性转换孔；VADC1为阴离子选择性通道蛋白；PINK1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；Parkin为泛素连接酶；LC3为自噬特异性蛋白

3.3 其他神经系统疾病

除了帕金森病(PD)[66]，现已在阿尔采默病(AD)[67]、亨廷顿舞蹈病(HD)[68-69]、传染性海绵状脑病(Prion disease)[70]及蛛网膜下腔出血[71-72]的神经细胞中发现自噬体，提示自噬除了参与神经系统退行性疾病的发病过程，还涉及脑血管病的病理生理过程。但究竟是通过自噬性死亡途径，还是信号通路抑或者是直接在基因水平调控自噬以及多大程度上依赖线粒体自噬，仍待进一步的研究。

4 总结与展望

了解选择性自噬及自噬-溶酶体途径对于正确把握线粒体自噬的分子机制以及具体发病机理有着深远的意义，将为深入理解线粒体自噬是如何参与中枢神经系统疾病的病理生理过程，发现新的潜在药物及治疗靶点提供有益的思路。譬如DUBs影响PINK1-Parkin信号通路的激活进而导致线粒体自噬的发生障碍，对应的药物应用于临床就可影响相关疾病的发展和预后。自噬作为一种新的缺血性脑损伤的干预靶点正得到越来越多的共识，已有基础研究专注于调控自噬的活性化合物筛选[73-74]。近年来也有一些临床前研究以干预自噬为靶点对中枢神经系统疾病进行治疗[75-79]，这也可能成为脑卒中及神经系统退行性疾病基础研究与潜在临床应用的新热点。对自噬的分子生物学机制的深入研究，尤其是对研究较少的选择性自噬发生机制的探索，将有助于寻找新的药物干预分子靶点[80-82]。线粒体自噬和其他非选择性自噬一样，自噬不足或过度对神经细胞都是有害的，尤其是对急性脑血管病，要想发挥线粒体自噬对神经细胞的保护作用，前期的体外研究中不仅需要对神经细胞活力与自噬流强度进行动态监测，还要严密记录线粒体功能及数量最佳时段，这或许才可以为线粒体自噬抑制剂(激动剂)治疗急性脑缺血提供指导意义。另外，促进线粒体自噬的治疗可能仅对线粒体自噬缺陷的PD患者有效，而鉴定线粒体自噬不足所致的疾病亚型例如检测和分析患者线粒体自噬分子机制的生物学标志物可能有助于确定对上调线粒体自噬治疗敏感的疾病亚型，从而可以开展针对性治疗。

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(2016-06-20收稿 2016-07-13修回)

武汉市科技攻关计划项目(编号为2013060602010270)作者单位：430060 武汉大学人民医院神经内科[方聪聪 毛善平(通信作者)董慧敏 刘宝辉 王舜]

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1007-0478(2017)02-0165-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.02.025