梁华，王燕，李奇玮，隋雨桐，闫起，刘丽玮

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

方剂研究

四君子汤补脾益气的主要有效成分与系统生物学刍议

梁华，王燕，李奇玮，隋雨桐，闫起，刘丽玮

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

四君子汤是经典补气方，临床多用于脾胃气虚证的治疗。随着中医药现代化研究的迅速发展，对于方证相关的生物学信息研究日益增多。本文从四君子汤发挥补脾益气作用的主要有效成分及现代药理学研究入手，结合基因组学、蛋白组学及代谢组学等方面探讨四君子汤补脾益气的作用及其对应证候的属性，为方证相关性研究奠定基础。

四君子汤；脾气虚证；方证相关；系统生物学

四君子汤由人参、白术、茯苓及甘草组成。方中君药人参大补元气、温养中焦，白术补脾益气为臣，佐以甘淡之茯苓，使参、术补而不滞，伍用炙甘草，甘温益气、补脾和中，共奏补益脾气之功效[1]。该方始载于《太平惠民和剂局方》卷三：“荣卫气虚、脏腑怯弱。心腹胀满，全不思食，肠鸣泄泻，呕哕吐逆，大宜服之。”可见四君子汤最早主要用于脾胃气虚、运化失调所致脾胃气虚诸证，脾胃虚弱则气血生化乏源，可见气短乏力、语声低微，不思饮食，大便溏薄等症状，脾虚还易引起健忘、注意力不集中，反应迟钝，后世众多补脾益气方剂多从此方衍化而来。

1 四君子汤主要有效成分及药理作用研究

四君子汤作为经典的补脾益气方剂，现代药理学研究多着重于其增强机体免疫功能，调节胃肠活动、胃肠激素，修复胃肠黏膜损伤，促进消化吸收等方面[2]。因具有抗肿瘤、抗突变及抗疲劳作用，常用于癌症放化疗的辅助治疗，此外四君子汤有促进内分泌腺功能、耐氧、修复肝脏和延缓衰老等作用[3]。中药活性成分是其发挥疗效的重要物质基础，Wang等[4]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术研究发现复方四君子汤的主要有效成分为多糖、皂苷、黄酮及挥发油类物质。

1.1 多糖类

多糖是重要的免疫调节剂，唐华羽等[5]通过脾虚造模探讨四君子汤多糖对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响，结果显示其可纠正肠道菌群失调，恢复脾虚小鼠的免疫功能。四君子汤中的多糖成分多来源于人参，其次是白术和茯苓。人参多糖对免疫抑制模型及刀豆蛋白A诱导的炎症模型小鼠都具免疫调节作用，其负相调节效应说明多糖有助于免疫稳态的维持[6]。白术多糖对体液免疫及细胞免疫均有调节作用，有学者发现白术多糖能够显著提高Kupffer细胞吞噬功能，增加Kupffer细胞释放NO和TNF-α等免疫因子[7]。而茯苓多糖能够活化环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠肠相关组织B细胞水平、促进淋巴细胞迁移，对肠道黏膜免疫系统的作用强于对外周免疫系统的作用[8]。

1.2 皂苷类

人参和甘草均含有皂苷类化合物。人参中的皂苷也是其主要的有效活性成分，其大部分是三萜苷元苷[9]。研究表明人参总皂苷能够升高机体细胞因子水平，还可通过上调肠道荧光假单胞菌和丁酸梭菌的数量，促进优势菌的增殖，抑制肠道病原菌的定植生长，从而调节胃肠功能[10-11]。甘草皂苷又称甘草酸，其对免疫活性细胞、细胞因子、补体等均有免疫调节作用，采用流式细胞术分析甘草酸对小鼠脾树突状细胞成熟及功能的影响，结果显示甘草酸可上调CD40、CD86和MHC-II的表达，从而促进细胞因子IL-12、IL-10及IFN-c的生成，减少IL-4生成[12-13]。

1.3 黄酮类

四物汤中的黄酮类化合物主要来源于甘草，甘草黄酮提取物可促进小肠隐窝上皮细胞IEC-6迁移，影响细胞内多胺调控信号通路，有助于胃肠黏膜损伤的修复[14]。刘冬羽[15]探究甘草总黄酮(LFs)治疗溃疡性结肠炎的机制，发现LFs不仅显著降低结肠湿重系数和结肠大体形态，还影响结肠组织MPO活性、减少NO含量的同时增加结肠组织GSH和SOD含量。幽门螺旋杆菌(Hp)是引起慢性胃炎、胃溃疡的重要致病因素，Hp感染后可诱导胃黏膜局部的细胞因子表达上调。杨行堂[16]等发现100 μg的甘草黄酮对Hp即具有一定的抑杀作用，为中药活性成分抑菌的运用提供了实验依据。

1.4 挥发油及其他

四君子汤中挥发类物质主要来自白术，白术挥发油中化学成分复杂，有苍术酮、白术内酯、β-桉叶醇等。其中苍术酮可以调节肥大细胞脱颗粒，抑制炎症反应，β-桉叶醇可通过抑制多巴胺D2受体和5-HT3受体来刺激小鼠胃排空，加速小肠蠕动[17-18]。四君子汤中除以上主要化学成分外，有学者还鉴定出没食子酸、苯甲酸，阿魏酸等有机酸物质[19]。

综上所述，随着对四君子汤复方活性成分的鉴定分析逐渐增多，使其更多的成分被人们所认识。复方中总化学成分药理作用的研究多偏重于探讨单味药，对复方整体的药效研究偏少。推测这一现状与药物组合后各化学物质可能发生变化，以及随着复方煎煮方法、剂型的不同，各化学成分含量将受到影响，用于药理学实验研究难以准确得出理想结果有关。

2 方证相关与系统生物学研究

系统生物学是从整体水平研究复杂生物所有基因、蛋白等组分的生命科学，它包含基因组学、蛋白组学及代谢组学在内的一系列组学技术，对中医证候客观化分析、复方分子机理研究有重大意义[20]。中医学中的整体观念融合了古代唯物论和辨证法思想，认为人体是一个内外联系、自我调节的有机整体[21]。中医的“证”既是病机的外在体现，也是辨证论治的前提条件。辨证论治与整体观念相结合是中医诊疗疾病的重要手段，而方证关系是辨证论治的重要组成部分，所蕴涵的重要科学问题是方与证间的关联性大小及其现代生物学基础[22-23]。随着系统生物学技术的迅猛发展，在与中医药现代研究的有力结合过程中，对方证关系的本质内涵进行了更全面的探究。

2.1 四君子汤方证与基因组学研究

基因组学是对生物体所有基因信息和染色体组成进行绘制遗传图谱和序列分析，从整体水平研究不同基因的结构与功能[24]。基因组学渗透到中医药研究后，多用于疾病相关证候基因表达的比较分析，从而揭示中药或复方干预相关证候的多途径调节作用。复方的功效主要是针对相对应的证候而言，根据以方测证，测定用药前和用药取效后两种不同状态的靶细胞的基因表达差异，来探讨证的相关基因或特异基因，将对中医证本质的研究有重要意义。

脾气虚证研究的动物模型常采用多因素联合造模，何丽娟等[25]检测了以饮食不节加力竭游泳所致脾虚大鼠胃组织中各基因的表达情况，结果显示cAMP、CREB、GP、PHK和PKA基因及蛋白表达均减少，而四君子汤能使以上基因表达升高，推测该方是通过激活胃cAMP-PKA信号转导通路来促进能量代谢，改善脾虚状态。田茸等[26]分别检测了脾气虚大鼠海马、小肠在不同时间段CaM信号转导通路关键基因CaM/CaMKⅡ及蛋白表达水平，比较不同组的干预效果，发现四君子汤通过影响CaM/CaMKⅡ表达对脾气虚证起到时相性动态干预。上述研究说明，信号通路中关键基因表达情况及基因组DNA转录后产生的mRNA的含量变化，可以体现四君子汤对脾气虚证模型动物的多靶点干预作用。

2.2 四君子汤方证与蛋白组学研究

蛋白质组学是指高通量、系统化的研究某一细胞、组织或者体液中全部蛋白质组成、功能及其动态变化规律的学科[27]。可以通过对比相关证候模型用药前后，细胞或动物器官组织的蛋白质表达谱的差异来了解方剂与其对应证候的关系[28]。

崔永霞[29]采用饮食不节加劳倦过度法建立脾气虚证大鼠模型，观察该模型大鼠回肠组织中的蛋白表达情况，发现脾气虚证与葡萄糖调节蛋白78和胰蛋白酶表达上调以及白蛋白下调相关。基于中医“心脾相关”理论，曹彬[30]采用蛋白质组学技术观察四君子汤对慢性心衰大鼠的作用，以肝脏组织为样本，筛选出表达明显增强的有NADH脱氢酶、甲状腺激素结合蛋白和角蛋白等8个蛋白，表达明显减弱的蛋白有钙网蛋白前体和HMG-CoA合成酶，这些蛋白参与的生物进程主要与能量代谢、内分泌及应激反应相关。而方焕松等[31]选用心肌组织为样本，发现四君子汤给药后31种蛋白质表达上调，28种蛋白质表达下调，最终鉴定出4种有显著差异的蛋白，分别为Suclg2蛋白、丙酮酸脱氢酶复合体、肌球蛋白轻链2和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N，说明四君子汤可以调节肌细胞能量代谢、改善心肌重构和提高心肌收缩功能。

2.3 四君子汤方证与代谢组学研究

代谢组学作为系统生物学中的重要组成部分，主要研究生物体在受到各种刺激后体内小分子代谢物功能状态的变化。早期分析技术的局限性使得生物样品中复杂代谢物的定性和定量化分析面临巨大挑战，随着先进技术手段的不断更新，结合多元统计分析，使得复杂样本的代谢产物鉴定更加精准，为中医药整体观下复方及证候研究提供了更多选择[32]。

甄毕贤等[33]采用LC-Q/TOF-MS技术研究脾气虚证大鼠血清代谢物谱的变化，发现大鼠血清中肉毒碱、棕榈酰肉碱、亚油肉碱、β-羟基丁酸、苯丙氨酸、PGA2、胆色素含量显著下降，而酵母氨酸和胞嘧啶等物质升高，四君子汤治疗后上述小分子代谢物的含量有不同程度的恢复。许家珍等[34]通过LC-MS技术平台，发现在脾虚小鼠血清中与激素调控有关的花生四烯酰基甘氨酸、花生四烯酸丝氨醇含量大幅下降，与脂肪酸氧化代谢相关的十四碳酰基肉碱和3-羟基棕榈酰基肉碱明显降低，而四君子汤复方多糖能使上述标志物含量接近正常组水平。以上研究说明四君子汤补脾益气的作用与调节脂类代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢通路，以及参与神经递质的释放、能量代谢有关。本课题组前期以自然衰老模型小鼠为研究对象，对比研究了四君子汤对不同月龄雌、雄小鼠的干预作用，发现随着增龄性改变，小鼠血浆样本中亮氨酸、花生四烯酸和谷胱甘肽显著降低而血栓素升高，肾脏组织中花生四烯酸、泛酸、辅酶A和焦谷氨酸等标记物出现紊乱，提示气虚证相关的代谢失调大多与糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢通路异常有关，四君子汤通过回调通路中多种差异物发挥作用[35-36]。

3 小结与展望

方剂是将各具特色的群药通过君臣佐使配伍形成的整体，通过调偏性、制毒性，与特定证候之间彼此作用，在辨证论治指导下方可发挥良效。所谓有是证则用是方，四君子汤是治疗脾气虚证的常用方剂，用四君子汤对脾气虚证模型进行干预来评价方剂效应，体现了方证对应关系。而方证对应是方证相关领域的一个方面，因同一证候可出现在不同的疾病中，同一疾病亦能呈现出不同证候，使得方证关系研究较为复杂。对于经典方剂的探讨，人们多致力于其药理作用及物质基础挖掘，且单味药的分析较多，复方中的单味药药理作用及主要活性成分研究体现了该方发挥功效的基础组成，对临床应用有一定指导意义。然而方剂疗效探究与对应证候密不可分，抛开证候只言药效并不完全符合中医理论的特点。此外，无论动物实验还是临床研究中，各种人为复制的病证模型难以满足对中医证候的充分体现。

随着系统生物学技术对中医药研究的冲击，更多学者通过基因组学、蛋白质组学及代谢组学多学科交叉融合来进行生物信息整体性研究。遗传信息可以体现方剂干预后机体基本生物进程的变化，通过基因网络的识别和关联分析，对比方剂效应和对应的证候在信号通路中相关基因谱的表达和蛋白质水平的异同，经统计分析找寻两者生物信息的契合点。然而生物体在特定条件和时间段中并非所有基因均充分表达或翻译，药物进入人体后的各种变化难以度量，使得一定条件下方证研究结果仍需考量，而代谢组学研究以更符合中医整体观为特点，对以上问题得以补充，将使方证关系的评价更加客观。系统生物学中多组学相互渗透互补，更多先进技术的汇入，在病证结合基础上运用以方测证研究模式将方药与证候紧密联系起来，用现代科学语言揭示方证关系的内在机制，在中医药方剂现代化的深入研究方面将有不可估量的应用前景。

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EffectiveIngredientsforInvigoratingSpleen-QiinSijunziDecoctioninTermsofSystemBiology

LIANG Hua,WANG Yan, LI Qi-wei, SUI Yu-tong,YAN Qi, LIU Li-wei

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Sijunzi decoction is a classic formula to supplement qi, which is often used in the treatment of spleen deficiency syndrome. With the rapid development of TCM modernization, relative biological studies were more paid attention to. This research discussed the effect of Sijunzi decoction on invigorating spleen and replenishing Qi and its corresponding syndrome based on genomics, proteomics and metabonomics, in terms of its main effective components and modern pharmacological research, which laid a solid foundation for the relationship between formula and syndrome.

Sijunzi decoction; Syndrome of spleen-Qi deficiency; Relationship between formula and syndrome; System biology

R285

A

1002-2392(2017)06-0096-04

2017-09-13

2017-10-20

国家自然科学基金项目(81473563)

梁华(1962-)，女，教授，博士研究生导师，主要从事衰老及营养代谢相关病症的方剂配伍研究。