沈　霖　　马　陈　　帅　波　　杨艳萍　　徐晓娟　　夏　雪　　吕　林

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉　430022



·临床研究·

非创伤性股骨头坏死患者ADAM17介导的凝血酶受体水解活性研究及加味青娥丸对其的干预效应*

沈霖马陈帅波△杨艳萍徐晓娟夏雪吕林

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉430022

摘要目的观察加味青娥丸对非创伤性股骨头坏死(ONFH)患者解离素金属酶17(ADAM17)介导的凝血酶受体水解活性的影响，探讨加味青娥丸治疗缺血性ONFH的机制。方法招募临床诊断为非创伤性ONFH患者60例，随机分为治疗组及对照组，治疗组给予加味青娥丸及补钙治疗，对照组给予模拟剂及补钙治疗，2组疗程均为6个月，2组患者适当限制运动及负重，另招募60例健康体检者作为健康组。抽取2组患者治疗前后及健康组静脉血，采用ELISA法检测受试者血浆中ADAM17表达水平；流式细胞仪检测受试者凝血酶受体GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα的表达，同步观察患者治疗前后髋关节功能评分(Harris评分)及髋部X摄片影像学变化，比较3组上述指标的差异。结果非创伤性ONFH患者ADAM17表达水平明显低于健康组；GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα高于健康组。治疗6月后，治疗组ADAM17显著高于对照组，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅠbα表达水平显著低于对照组；治疗组髋关节Harris评分优于对照组；2组髋部X摄片影像学无明显差异。结论中药加味青娥丸方提高非创伤性ONFH患者低于正常的ADAM17含量，调节其介导的凝血酶受体水解活性，可能是本方治疗非创伤性ONFH患者的疗效机制之一。

关键词股骨头坏死；青娥丸；解离素金属酶；凝血酶受体

非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head，ONFH)的发病机制复杂，多由于应用激素及过度饮酒等导致机体脂肪代谢紊乱及血管内凝血，形成血栓或脂肪栓子，堵塞股骨头滋养血管，使骨质缺血、变性、坏死[1-3]。前期的研究[4-6]已经证实，股骨头缺血性坏死患者血小板高聚集，血液呈高凝低纤溶状态，循环血中可溶性GPⅠbα糖盏蛋白(glycocalicin，GC)的含量明显低于正常。近年来研究[7-8]发现，GC是血小板膜上一种解离素金属酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)17水解凝血酶受体(glycoprateins，GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物的关键组分GPⅠbα，释放出的胞外段功能区形成可溶性分子。长期的临床实践[9-10]表明，运用古方青娥丸加丹参治疗ONFH，具有补肾活血之功。为此，本文观察了非创伤性ONFH患者ADAM17介导的凝血酶受体水解活性的变化及加味青娥丸对其的干预效应，旨在探讨中医补肾活血法治疗非创伤性ONFH的疗效机制，现将结果报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

搜集2013年10月—2015年6月在华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合骨伤科门诊就诊的ONFH患者60例，其中男26例，女34例，平均年龄(38.12±3.90)岁。其中12例有长期饮酒史，35例有激素使用史，另外13例原因不明。根据国际骨循环研究会(Association Research Circulation Osseous，ARCO)诊断分型，其中Ⅱ型35例，Ⅲ型43例；单侧ONFH 36例，双侧ONFH 24例。经中医辨证属于血瘀肾虚型。

60例患者随机分为加味青娥丸治疗组(治疗组)及青娥丸模拟剂治疗组(对照组)，每组各30例。治疗组，其中男12例，女18例；平均年龄(37.24±3.63)岁；平均体重指数(23.38±3.14) kg/m2；髋关节的ARCO分期：Ⅱ期17髋，Ⅲ期22髋。对照组，其中男14例，女16例；平均年龄(39.32±2.94)岁；平均体重指数(23.69±4.12) kg/m2；髋关节的ARCO分期：Ⅱ期18髋，Ⅲ期21髋。2组患者在性别、年龄、体重指数及髋关节ARCO分期等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另选60例门诊体检中心健康体检者为健康组，其中男26例，女34例；平均年龄(37.28±4.10)岁，体检正常，均无长期饮酒及激素使用史，既往无心脑血管、高血压、糖尿病病史。本研究已得到武汉协和医院研究中心伦理委员会批准，所有参加本研究的受试者均表示同意并签署知情同意书。

1.2排除标准

所有入选患者均排除：①具有明确的髋关节外伤史；②合并有严重的心、肝、肺、肾疾病、脂质代谢紊乱及血液系统疾病；③妊娠或准备妊娠或哺乳期妇女；④在本检查前2周内，服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀类中药等影响血小板功能的药物；⑤研究者认为不宜入选本试验者。

1.3方法

1.3.1试验用药加味青娥丸由补骨脂160 g(酒浸，炒)，杜仲80 g(去皮，姜汁浸，炒)，胡桃(去皮、膜)60个，丹参160 g组成，中药饮片均购自湖北省中药材公司，上药为细末，蒜(熬膏)60 g，蒜膏为丸。对照药除辅料外不含任何药物成分，剂型、规格与加味青娥丸相似。2种药物均由华中科技大学同济医学院附属协和医院中药房制作。钙尔奇D(国药准字H10950029)为惠氏制药有限公司产品。

1.3.2治疗方法治疗组口服加味青蛾丸，每次15 g，每日3次；对照组服用加味青娥丸模拟剂，每次15 g，每日3次。2组均同时服用钙尔奇D，每次600 mg/片，每日1次。治疗期间禁止使用其他影响骨代谢及降脂作用的中西药物。2组用药同时均采用患髋皮牵引辅助治疗，每日2次，每次1 h，同时患髋避免负重活动，必要时配合扶拐行走。2组疗程均为6个月。

1.4临床评价与观察指标

1.4.1临床评价记录所有受试者的年龄、性别、身高、体重。在入组时及每次随访行髋关节功能评分(Harris评分)，在治疗前及治疗6个月后均行双髋关节正侧位X摄片。1.4.2ADAM17检测人ADAM17(TACE)ELISA试剂盒由西塘公司提供，采用双抗体夹心ABC-ELISA法进行检测。经肘正中静脉采集所有受试者治疗前后及健康体检者清晨空腹静脉血，分离血浆。标准品液配制：使用前加入1 ml蒸馏水混匀，配成20 ng/ml的溶液，设标准管8管，第1管加标本稀释液900 μl，第2～8管加入标本稀释液500 μl。在第1管中加入20 ng/ml的标准品溶液100 μl混匀后，用加样器吸出500 μl，移至第2管，如此反复作对倍稀释，从第7管中吸出500 μl弃去，第8管为空白对照。10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释(示例：1 ml浓稀释液加入9 ml蒸馏水)。洗涤液：用重蒸水1：20稀释(示例：1 ml浓缩洗涤液加入19 ml的重蒸水)。加样：每孔各加入标准品或待测样品100 μl，将反应板充分混匀后置37 ℃、120 min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，在滤纸上印干，每孔中加入第一抗体工作液100 μl，将反应板充分混匀后置37 ℃、60 min；每孔加酶标抗体工作液100 μl，将反应板置37 ℃ 30 min；每孔加入底物工作液100 μl，置37 ℃暗处，反应15 min；每孔加入100 μl终止液混匀，30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光值。

1.4.3GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ与GPⅠbα检测藻红素(phycoerythrin，PE)标记的GPⅠbα单克隆抗体CD42b为美国BioLegend公司产品，GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物单克隆抗体CD42a-b-c-d为美国ALEXIS公司产品，异硫氰酸荧光(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记二抗为美国KPL公司产品。采用真空采血管(美国BD公司)，清晨空腹静脉血3 ml，以3.8%枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂的比例为9：1。将抗凝后全血，以1%多聚甲醛固定45 min，取50 μl加至流式检测管，后分别在不同管中加入20 μl GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物单克隆抗体CD42a-b-c-d和PE标记的GPⅠbα单克隆抗体CD42b，混匀，室温避光孵育30 min，然后在CD42a-b-c-d标记的样本中加入20 μl FITC标记的羊抗鼠IgG，混匀，室温避光孵育30 min。用0.2 M PBS定容至500 μl，于FACS420型流式细胞仪上检测，每个样本分析104个/血小板，结果以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.5统计学处理

2结果

2.1治疗前后Harris评分与髋关节X摄片

治疗组30例中，有28例(35髋)患者完成了本试验，2例患者脱落，其中1例因治疗4周后，症状无改善要求退出，1例因治疗过程中，到国外探亲，未按期用药。对照组30例中，有27例(34髋)患者完成了本试验，2例因疗效不佳要求退出，1例失访。治疗前2组患者的髋关节Harris评分无明显差异(t=0.275，P=0.784)。治疗6个月后，治疗组Harris评分显著高于治疗前(t=5.490，P<0.001)；对照组治疗前后差异无统计学意义(t=1.622，P=0.111)，且治疗后治疗组患者Harris评分明显高于对照组(t=2.954，P=0.005)。2组治疗前后X摄片影像学无变化。见图1。

与治疗前比较*P<0.05；与对照组比较▲P<0.05图1　治疗组与对照组Harris评分图

2.23组ADAM17、GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα检测

治疗前，治疗组与对照组ADAM17水平比较无明显差异(t=0.372，P=0.711)，但均明显低于健康对照组(t=2.934，P=0.004；t=2.333，P=0.022)。治疗6个月后，治疗组ADAM17水平明显高于治疗前与对照组(t=3.786，P<0.001；t=2.736，P=0.008)；对照组与治疗前比较无明显差异(t=0.126，P=0.901)。见图2。

与健康组比较△P<0.05；与治疗前比较*P<0.05；与对照组比较▲P<0.05图2　3组ADAM17表达水平的图

治疗前，治疗组与对照组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ水平比较无明显差异(t=0.023，P=0.982)，但均明显高于健康对照组(t=3.344，P=0.001；t=3.122，P=0.002)。治疗6个月后，治疗组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ水平明显低于治疗前与对照组(t=2.556，P=0.013；t=2.698，P=0.009)；对照组与治疗前比较无明显差异(t=0.185，P=0.854)。见图3。

与健康组比较△P<0.05；与治疗前比较*P<0.05；与对照组比较▲P<0.05图3　3组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ表达水平图

治疗前，治疗组与对照组GPⅠbα水平无明显差异(t=0.169，P=0.866)，但均明显高于健康对照组(t=2.725，P=0.008；t=2.813，P=0.006)。治疗6个月后，治疗组GPⅠbα水平明显低于治疗前与对照组(t=2.268，P=0.027；t=2.471，P=0.017)；对照组与治疗前比较无明显差异(t=0.092，P=0.927)。见图4。

与健康组比较△P<0.05；与治疗前比较*P<0.05；与对照组比较▲P<0.05图4　3组GPⅠbα表达水平图

3讨论

既往研究已经证实[4-5]，非创伤性ONFH患者血小板聚集功能增加，血流动力学呈高黏血症状态，血小板GPⅡb/Ⅲa、P-选择素、血小板微颗粒等血小板活化指标的表达明显高于健康人，提示这可能是导致本病患者血液处于高凝易栓塞状态的重要原因之一。

近年来发现，非创伤性ONFH患者循环血中GC含量低于正常[6]。有文献[7-8]表明，血小板膜表面蛋白水解在调节血小板功能方面起重要作用。血小板表面的凝血酶受体GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物亚基GPⅠbα，可被血小板膜上的ADAM17水解，释放出胞外段功能区形成可溶性分子GC。病理情况下，一旦ADAM17的调节发生障碍，血小板上GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物亚基酶解减少，该复合物作为凝血酶受体，将过度与凝血酶和vWF结合，使血小板活化增加，这些改变将引起血管内凝血。

本研究发现，非创伤性ONFH患者血浆ADAM17含量降低，血小板表面凝血酶受体GP Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其关键活性亚基GPⅠbα均高于正常，表明非创伤性ONFH患者确实存在ADAM17介导的GPⅠbα水解功能障碍。由此分析，ONFH患者各种始发、触发因素，如大量饮酒、激素药物的使用、骨髓压力升高及细胞的毒性作用等使血管内皮细胞受损，其下胶原暴露，体内产生一系列的生物活性因子及相关反馈等共同作用使得ADAM17不能有效水解凝血酶受体，故出现循环血中GC减少。凝血酶受体与凝血酶和vWF结合增加，从而激活血小板，使血细胞聚集，活化的血小板产生大量的GPⅡb/Ⅲa、P-选择素及血小板微颗粒，使血液处于高凝状态，易形成微循环血栓、栓塞，再加上股骨头本身的血供特点，易阻断股骨头血供从而导致股骨头缺血性坏死。

非创伤性ONFH属于中医“骨蚀”、“骨痹”范畴，病理机制主要为肾虚血瘀。长期服用激素可损伤肾气，气虚血运无力成瘀；过度饮酒之热及肾，肾因火而精少；血受热而成痰瘀，痰瘀互结，血脉痹阻不通，骨失所养，而成骨痹、骨蚀。治宜补肾活血，结合我们前期研究[4-6]，采用古方青娥丸加丹参治疗本病。方中杜仲性味甘温，入肝肾经，能补肾、强壮筋骨，故有“凡下焦之虚非杜仲不补，足胫之酸非杜仲不去，腰膝之病非杜仲不除”之说(《本草几言》)；补骨脂性温能“暖水脏，阴中生阳壮火益土，对“肾气虚弱，……起坐艰难者，悉能治之”(《本草经疏》)；胡桃肉入肾，补肾固精、通润血脉；大蒜辛温走窜，行滞通络。四药合为青娥丸，“治肾气虚弱，……坐起艰难，俯仰不利，转侧不能，……常服之，壮筋骨，活血脉，乌鬓发，益颜色”(《局方·青娥丸》)，再加用丹参活血化瘀，诸药相得益彰，共奏内充肾气、调达气血之功。经临床验证，本方在缓解患髋疼痛，促进患髋关节功能改善方面疗效明显[7]。本研究结果显示，用本方治疗6个月，能有效的干预患者低于正常的ADAM17含量，使其对GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物及GPⅠbα水解活性恢复正常，从而改善血小板活化状态，以达到控制血管内凝血，恢复血小板聚集功能之功，提示加味青娥丸治疗非创伤性ONFH的疗效机制之一，是能够在受体蛋白水平上调节ADAM17介导的凝血酶受体水解活性。有关本方调节血小板凝血酶受体作用的详细机制有待进一步研究。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4616.2016.03.001

(收稿日期：2016-04-07)

Study on Hydrolysis Activity of Thrombin Receptor Mediated by ADAM17 in Patients with Nontraumatic Osteonecrosis of the Femoral Head and Intervention Effect of Modified Qing’e Pills

SHEN Lin，MA Chen，SHUAI Bo△，et al

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo observe the intervention effect of modified Qing’e pills on the hydrolysis activity of thrombin receptor mediated by ADAM17 in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head(ONFH)，and to explore its possible mechanism.Methods60 patients with nontraumatic ONFH were randomly divided into a treatment group and a control group.The treatment group was treated with modified Qing’e pills while the control group was treated with simulated pills.Both groups were given Caltrate D.All patients in the two groups received treatment for six months.Another 60 cases of healthy people accepted heath examination were as a healthy group.Plasma levels of ADAM17 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，and platelet membrane glycoproteins(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ complex and its component GPⅠbα were analyzed by flowcytometry in the healthy group and the two intervention groups before and after treatment.While X-ray examination of the hip and Harris hip score were measured in patients with ONFH before and after treatment.ResultsThe level of ADAM17 in patients with ONFH were significantly lower than that in the healthy group(P<0.05).The expression of GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ and GPⅠbα in patients with ONFH were significantly lower than that in the healthy group(P<0.05).After six months treatment，the level of ADAM17 in the treatment group were significantly higher than that in the control group(P<0.05)，and expression of GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ and GPⅠbα in patients with ONFH were significantly lower than that in the control group(P<0.05).Harris hip score in the treatment group was significantly higher than that in the control group.Difference of X-ray examination of the hip was not significant between the treatment group and the control group after treatment(P>0.05).ConclusionModified Qing’e pills may play a protective role against nontraumatic ONFH by regulating the expression adiponectin signaling pathway and ghrelin.The partial mechanism of treating ONFH of modified Qing’e pills is suggested that ADAM17 content is increased in the plasma and hydrolysis activity with thrombin receptor is regulated by ADAM17.

Key wordsosteonecrosis of the femoral head；modified Qing’e pills；ADAM17；thrombin receptor；GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ；GPⅠbα

*国家自然科学基金项目(No.81273907,81403257)

△通信作者，Corresponding author，E-mail：bobo3137@126.com