林雁嘉 黄楚韩 林雯 林明恩 郑道城 蔡林河

【摘要】目的：探讨肿瘤坏死因子TNF-α-308、TNF-α-238位点基因多态性与梅毒发病的关系。方法：采用等位基因特异引物聚合酶链反应（AS-PCR）分析显性梅毒组（A组）共93例；潜伏梅毒组（B组） 共55例以及正常对照组（C组）41例 TNF-α-308、TNF-α-238位点基因多态性。结果：三组TNF-α-308位点等位基因、基因型频率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。三组TNF-α-238位点等位基因频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；TNF-α-238位点基因型频率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：人梅毒患者中TNF-α-308 A和238A的存在过度表达，且TNF-α-308、238位点基因多态性与梅毒的发病及病程进展可能有关系。

【关键词】梅毒；肿瘤坏死因子-α；多态性；单核苷酸

【中图分类号】R759.1【文献标志码】A

机体感染了梅毒螺旋体后，其临床症状表现多样化、程度轻重不一；可以表现为显发梅毒，也可为潜伏梅毒；不同患者对治疗的反应性和敏感性不同，其临床疗效也相差甚远。这提示我们梅毒螺旋体本身可能存在基因与决定遗传易感性中起到关键作用＼[1，2＼]，可能与机体发生免疫应答的强度相关，可决定梅毒感染的发生、发展及转归等方面。

目前，国内外关于人类梅毒遗传易感性方面的研究尚未见深入报道。我们通过借鉴其他诸如乙型肝炎病毒、HIV及结核等感染性疾病的遗传易感性的研究，拟选用梅毒免疫发病中与抗原识别摄取相关的Thl反应性细胞因子TNF-α作为研究的目的基因，通过对其基因SNP位点的分析，探讨其与梅毒易感性的关系，为今后的临床诊治提供新的理论和实验基础。

1材料与方法

1.1病例分组

病例148例为我院确诊为早期梅毒（梅毒血清学检查RPR、TPPA阳性，病程<2年）患者。其中男91例， 女57例； 平均年龄（31.5 ±6.4）岁； 有典型的临床症状及体征（出现硬下疮、扁平湿疵、掌拓红斑等皮疹）的患者为显性梅毒组（A组）共93例；未出现典型临床症状和体征的患者为潜伏梅毒组（B组） 共55例。正常对照均为同期健康献血者，经献血前常规体检排除乙肝、HIV感染（C组）。

1.2方法与步骤

1.2.1主要试剂和仪器96孔PCR仪（Roche公司，美国，型号LightCycler 96）；血液基因组提取纯化试剂盒（Promega，型号MD1360，美国）；凝胶成像系统（UVP，型号Biodoc-IT 220美国）。

1.2.2基因组DNA的提取和纯化采用含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K）的抗凝管抽取各组受测者的空腹外周静脉血3mL，应用基因组提取纯化试剂盒提取基因组DNA。采用12000r/min转速室温离心15min，提取血样的基因组DNA，并保存于-20℃冰箱以备检测使用。

1.2.3分析TNF-α-238和308位点的基因多态性于美国国立生物技术信息中心官方网站上查询并获得人类TNF-α基因的全序列，利用Primer 5.0软件设计各个序列引物，引物委托上海生工有限公司合成。采用聚合酶链反应一限制性片段长度。多态性（PCR-RFLP）分析，并完成扩增。TNF-α-308 G/A 扩增引物序列为：上游引物： 5- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3，下游引物序列：5 - TCCTCCCTGCTCCGATTCCG -3，产物大小156 bp；TNF-α-238 G/A扩增引物序列：上游引物：5-ATCTGGGGAACGGTAGTG-3 ，下游引物序列：5-AGAAGACCCCTCGGAACC-3，产物大小164 bp。

扩增反应体系总体积为25μL，包含有PCR Master Mix 12.5μL，cDNA模板2μL，上下游引物各1μL。扩增反应条件为：95°C预变性2 min，然后94°C变性1 min，64°C退火1min，72°C延伸1min；循环进行35次，末次再于72°C延伸5min，4°C冷却终止反应；产物取出后加入限制性内切酶MspI5U，于-20°C冰箱保存。采用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增的产物，并鉴定目的基因的等位基因及基因型，电脑软件凝胶成像进行分析图像。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0软件分析。两组资料比较：计量资料采用独立样本t检验或计数资料的χ2检验；多组计量资料比较采用方差分析，用Hard-Weinberg遗传平衡法分析检验样本的群体分布是否符合遗传规律。检验水准为a<0.05。

2结果

2.1血清DNA片段琼脂电泳分离鉴定结果

电泳可见单一清晰条带，表明所提取的DNA无降解。见图1。

2.2TNF-α-238等位基因基因型的鉴定

PCR产物出现了近206bp的条带，为野生型纯合子GG基因型；出现280bp的条带，为野生型纯合子AA基因型；出现206与280bp的两条条带，为突变型杂合子GA基因型。见图2。图2TNF-α-238等位基因基因型的鉴定

2.3TNF-α-308等位基因基因型的鉴定

PCR产物出现了近135bp的条带，为野生型纯合子GG基因型；出现350bp的条带，为野生型纯合子AA基因型；出现135与350bp的两条清晰条带，为突变型杂合子GA基因型。见图3。图3TNF-α-238等位基因基因型的鉴定

2.4TNF-α-238、308等位基因及基因型的频率

采用Hard-Weinberg遗传平衡法分析检验TNF-α-238和308等位基因与基因型在两组（显性A组、潜伏梅毒B组）中的分布规律均符合遗传平衡定律，样本均来自平衡群体，具备较好的代表性（P<0.05）。

根据表1所示，A组、B组的TNF-α-238位点G/A位点基因型频率相比较，差异有统计学意义（P =0.037），与C组相比较也均有统计学意义；而A组、B组的TNF-α-238位点G/A等位基因频率相比较，差异无统计学意义（P =0.135）。A组、B组的TNF-α-308位点G/A位点基因型频率和等位基因频率相比较，差异均有统计学意义（P值分别为0.025，0.019），位点基因型频率和等位基因频率与C组相比较也均有统计学意义。见表1、表2。

表1TNF-α-238G/A位点基因型频率和等位基因频率相比较组别例数基因型G/GG/AA/A等位基因GAA9381112*#17115B554951*#1037C413821774注：*与C组对照P<0.05；# A组与B组对照P<0.05

3讨论

TNF-α基因位于6号染色体P21区域内，目前研究证实TNF-α的基因多态性与很多疾病的发病和进展有关，诸如感染性疾病、自身免疫性疾病、血液病以及恶性肿瘤等。目前研究已知TNF-α启动子区域有11个单核苷酸多态性区域（SNPs），TNF-α基因多态性的位点目前研究主要有-308、-238、-376、-244、-857、-1031以及-863等，其5端为高突变区；其中TNF-α-238和TNF-α-308两个位点的研究最为深入和重要＼[3，4＼]。目前国内外TNF-α基因多态性在梅毒方面的研究尚属不多。研究表明，这两个位点与机体对慢性病毒类感染的清除缓解有关＼[5，6＼]。

当前研究结果表明，TNF-α的产生除了机体本身的自身免疫系统活化有关之外，还与TNF-α的基因启动子区域的基因多态性而影响其转录特性并使得影响转录产物的表达水平有关。再者不同的基因型可以转录并产生拥有不同生物特性的蛋白，并可表现出不同的生物活性及疾病的易感性和严重程度。但TNF-α-238和308两个位点的基因多态性是否导致了梅毒感染患者的遗传易感特性以及在临床上产生了不同的结局和严重程度，目前尚无明确定论＼[7，8＼]。

TNF-α是当梅毒螺旋体进入人体感染后刺激朗格罕氏细胞、巨噬细胞分泌而成，具有调节炎症免疫系统的作用，介导细胞毒T细胞为主的细胞免疫，增强抗原递呈与表达，激活巨噬细胞和补体系统，在杀伤病原体中发挥重要作用＼[9，10＼]。目前研究显示：梅毒感染的病程早期以细胞免疫为主，梅毒螺旋体主要引发宿主的细胞免疫，进而杀伤清除体内的病原体，并引起组织损害，表现为不同的临床体征和症状＼[11-14＼]。

本研究对梅毒患者TNF-α-308、238两个位点等位基因及基因型进行鉴定，并与正常人群对照组进行比较。我们的研究显示，显性梅毒组、潜伏性梅毒和对照组TNF-α-308位点基因型的分布频率存在差异。我们的研究结果表明，两组试验组TNF-α-308 G/A、A/A基因型频率明显高于对照组的基因型频率；两组的TNF-α-308 A等位基因频率也明显高于对照组。显性梅毒组TNF-α-308的A基因频率和基因型均比、潜伏性梅毒的要高，差异具有统计学意义；而国内刘春等＼[15＼]曾研究梅毒患者和正常人中TNF-α-308位点基因多态性进行分析，结果认为TNF-α-308位点基因多态性与梅毒的遗传易感性无明显关系。

本研究显示，两组试验组TNF-α-238 G/A、A/A基因型频率均明显高于对照组，但其等基因频率却无统计学差异；可能与样本量不足有关。

综上所述，我们认为TNF-α的基因多态性在机体梅毒感染的发生和病程发展中发挥关键作用，与梅毒的细胞免疫系统激活和调节密切相关；TNF-α-308 A及238A等位基因可能是人类感染梅毒的遗传易感因子，TNF-α的基因多态性与梅毒发病和病程进展以及转归有一定的相关性。但研究结果仍需多中心大样本试验的进一步验证。

参考文献

＼[1＼]Allstaff S， Wilson J. The management of sexually transmitted infections in pregnancy. The Obstetrician & Gynaecologist，2012（14）：25-32.

＼[2＼]Smith JM， Tsang R， Kadkhoda K， et al. Tonsillar syphilis： an unusual site of infection detected by Treponema pallidum PCR. J Clin Microbiol， 2015（53）： 3089 - 3091.

＼[3＼]Hook EW III， Behets F， Van Damme K， et al. A phase III equivalence trial of azithromycin versus benzathine penicillin for treatment of early syphilis. J Infect Dis， 2010（201）：1729-1735.

＼[4＼]Li Z， Xue J， Yan S， et al.Association between tumor necrosis factor-α-308 G/A gene polymorphism and silicosis susceptibility： a meta analysis. PLoS One，2013， 8（10）：e76614.

＼[5＼]Scardapane A， Ferrante R， Nozzi M， et al. FRI0504 TNF-alpha gene polymorphisms and juvenile idiopathic arthritis： influence on disease outcome and therapeutic response. Ann Rheum Dis， 2015（74）：611-612.

＼[6＼]Hedl M， Abraham C， et al. A TNFSF15 disease-risk polymorphism increases pattern-recognition receptor-induced signaling through caspase-8–induced IL-1. PNAS， 2014（111）：13451-13456.

＼[7＼]Kazzi NJ， Kim UO， Quasney MW， et al. Polymorphism of tumor necrosis factor-α and risk and severity of bronchopulmonary dysplasia among very low birth weight infants. Pediatrics， 2004（114）： e243 - e248.

＼[8＼]Gonzále F， Rote NS， Minium J， et al. In vitro evidence that hyperglycemia stimulates tumor necrosis factor-α release in obese women with polycystic ovary syndrome. J Endocrinol， 2006（188）：521-529.

＼[9＼]Shi KQ， Cai XH， Xiao DD， et al. Necrosis factor-a-857T allele reduces the risk of hepatitis B virus infection in an Asian population.Journal of Viral Hepatitis， 2012， 19 （2）：e66-e72.

＼[10＼]Pantelidis P， Lympany PA， Foley PJ， et al. Polymorphic analysis ofthe high-affinity tumor necrosis factor receptor 2. Tissue Antigens， 1999， 54 （6）：585-591.

＼[11＼]Derakhshani S， Ghavami B， Damavand B， et al. Association of polymorphisms with gastric cancer： single nucleotide polymorphisms in promoter or micro RNA bingding sites？ Ann Onc， 2014（25）： iv223 - iv224.

＼[12＼]Wijnen PA， Cremers JP， Nelemans PJ， et al. Association of the TNF-α G-308A polymorphism with TNF-inhibitor response in sarcoidosis. Eur Respir J， 2014（43）： 1730 - 1739.

＼[13＼]Wouters MM， Lambrechts D， Becker J， et al. Genetic variation in the lymphotoxin-α （LTA）/ tumour necrosis factor-α （TNFα） locus as a risk factor for idiopathic achalasia. Gut， 2014（63）：1401-1409.

＼[14＼]Rowley D， Swiecki P， Burkacka EF， et al. Clinical and epidemiological characteristics of patients with earlysyphilis from three academic centres in Poland， Germany and Ireland： initial findings from the POETS study. Sex Transm Inf， 2015（9）：389-394.

＼[15＼]Lin CY， Yang YF， Fang IF， et al. The relationship between bone and joint tuberculosis and TNF-a1pha gene polymorphism. Chinese Journal of Spine and Spinal Cord， 2011，21（5）：427-429.

（收稿日期：2015-07-24）