葛丽特，段 答，王 磊，赵振宇，滕晓华，卢 明

（1.湖南师范大学第二附属医院，解放军第 163 医院，神经外科，长沙 410003；2.湖南师范大学医学院，长沙 410006）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类多能成体干细胞，因其在干细胞移植、神经修复、细胞组织工程等中具有重要作用，近年来成为干胞研究的热点之一。目前其主要来源为成人骨髓，但骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高［1，2］，且采集须行骨髓穿刺术，从而使间充质干细胞的临床应用受到限制。

嗅黏膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs）也称为外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells，OE-MSC）［3］。 又因为定位于嗅黏膜固有层中，所以也称嗅黏膜固有层间充质干细胞（lamina propria mesenchymal stem cell，LP-MSCs）［4，5］。OM-MSCs 在体外易于提取培养，并能保持其多向分化潜能，鼻内分布广泛［6］，不受年龄相关性影响［7］，遗传背景稳定［8］，安全性高，自体移植，无免疫排斥反应，成为组织工程的理想的种子细胞［9］。本研究从人的鼻嗅黏膜中分离出MSC，并研究细胞的形态学特征、细胞的生长特性、细胞周期和其免疫表型等特性，旨在建立OMMSCs的培养和鉴定方法，初步探讨其生物学特性，为鼻黏膜OM-MSCs自体移植修复组织损伤提供细胞来源基础。

1 材料与方法

1.1.1 实验材料 鼻嗅黏膜取自鼻腔健康的志愿者（在签署知情同意书后且经过湖南师范大学伦理委员会批准）。

1.1.2 试剂及仪器 高糖DMEM-F12 培养基（1∶1）（GIBCO 公司，美国）；体积分数为10%小牛血清（HyClone 公司，澳大利亚）；双抗（青霉素20 000U/mL、链霉素 20000 ng/mL）；胰蛋白酶消化液、细胞培养专用冻存液；鼠抗人单克隆抗体CD34-GCD、CD45-PCT、CD90-FITC、CD105-PE、CD73-FITC（Sigma 公司，美国）；CO2培养箱；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；脂肪组织诱导剂和骨组织诱导剂（GIBCO 公司，美国）；油红O、茜草红（GIBCO 公司，美国）、MTT；鼻嗅黏膜征得病人家属同意且予以知情同意书签字。

1.2 方法

1.2.1 OM-MSCs的取材和原代培养 鼻嗅黏膜获取前三天，病人准备，签署志愿书，排除嗅黏膜损伤、萎缩性鼻炎等嗅黏膜疾病，鼻毛清理，滴加氯霉素。获取前鼻内麻醉，取中鼻甲靠根部内侧。鼻嗅黏膜取出后用无血清高糖DMEM/F-12混合培养基（含青霉素100U/m L 和链霉素100U/m L）清洗3次去除血迹和杂质，然后放置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基（含青霉素100U/mL和链霉素100U/mL）的培养皿中，用眼科剪剪碎组织块，剪成1mm3大小，离心1000转5分钟后，弃上清液，接种于Corning 培养瓶，置CO2培养箱内（37℃，5% CO2，饱和湿度）培养。之后每隔3天将细胞换液，当细胞铺满瓶底达到>80%融合时进行消化、传代。将第5代细胞离心和接种于6孔细胞培养板，分别用于OM-MSCs流式细胞术鉴定检测和诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞。

1.2.2 形态学观察 每日在倒置显微镜下观察细胞，生长情况和细胞形态并照相。

1.2.3 OM-MSC s的细胞表面标志测定 取第5代细胞，用质量分数为0.125% 胰蛋白酶消化后，终止消化，将细胞用PBS洗涤3 次，进行分管，每管0.1m L。阴性对照管加入抗人IgG-FITC、IgG-PE；其它管分别加入鼠抗人抗体CD34-PE、CD45-PE、CD73-FITC、CD90-FITC，室温孵育30min，流式细胞仪进行检测。

1.2.4 OM-M SCs体外定向诱导分化 选择第4代OM-MSCs，按2.0×106/mL接种于放置有多聚赖氨酸处理过的无菌盖玻片的6孔板内，待细胞贴壁生长细胞融合达80%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入下列诱导剂：①成脂细胞诱导剂（StemPro，Invitrogen，UK），②成骨细胞诱导剂（StemPro，Invitrogen，UK）。每3～ 4天换液1次，以未加诱导培养液的细胞培养孔作为对照，成脂细胞诱导剂诱导2周后，经4%多聚甲醛固定15min，对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染；成骨细胞诱导剂诱导3周后，经4%多聚甲醛固定15min，对诱导分化的成骨细胞进行茜素红染色。

1.2.5 细胞生长活性测定 取第3代细胞，调整细胞密度为5×103/m L，接种于96细胞培养孔板内，用无细胞培养液作为空白对照，连续7天利用MTT法进行检测，每组6孔，于492nm 处分光光度计检测各组细胞的光吸收值（A 值），重复3次，取其均值和标准差绘制生长曲线。

1.2.6 细胞周期检测 取第4代的细胞，胰蛋白酶消化1～5min，调整细胞密度为1.0×106/m L～2.0×106/mL，PBS洗涤3次，加入1m L体积分数为70% 的预冷的乙醇，充分吹散制成单细胞悬液，4 ℃冰箱中固定24 h 后、离心、去上清、沉淀物重悬在1mL碘化丙啶中（含RNA ase A 质量浓度 10 Lg /mL，PI质量浓度 50 Lg /mL），4℃ 孵育20min，以流式细胞仪检测分析细胞周期。

2 结果

2.1 OM-MSCs的获取及形态观察 根据文献报道，嗅黏膜间充质干细胞最先发现在嗅黏膜区因此得名，最新研究显示OM-MSCs广泛分布于鼻腔中［10］，以中鼻甲与上鼻甲居多，组织取自中鼻甲根部区嗅黏膜，取出的粘膜面积大概2cm3，取后志愿者的嗅黏膜一个月可恢复，且通过嗅觉实验证明对于病人的嗅觉无影响（图1A、B）。

采用组织贴壁法，组织块多于24h内可贴壁，7天内大部分细胞爬出（图1C），细胞呈间充质干细胞典型的细胞形态，呈梭形、多角形。原代细胞生长至约14天时可达到80%融合进行传代，传代后的细胞生长速度明显加快，约2~3天即可传代1次，传代次数可达到10次以上。传代到第3时细胞纯度较高，形态上更为均一，以间充质细胞典型的平行排列生长为主，或呈漩涡状生长［11，12］（图1D）。

2.2 OM-MSCs的细胞表面标志分析 经流式细胞术检测，OM-MSCs表达间充质干细胞一般标记物，黏附分子CD73和基质细胞标记CD90，不表达造血干细胞标志CD34和CD45（图 2）。

2.3 诱导分化

2.3.1 OM-M SCs成脂诱导分化的形态变化及油红O染色 经成脂诱导后的OM-MSCs，其形态由典型的长梭形逐渐变短、变胖，呈短胖梭形、椭圆形或圆形。诱导7d 后，在光镜下可看见具有强折光性的空泡，提示脂滴开始形成。随着诱导时间延长，胞浆内的脂滴增多。诱导后的细胞经油红O染色，可见胞浆中有大量被染成红色的脂滴（图2A 、C），说明OM-MSCs在体外有向脂肪细胞分化的潜能。

2.3.2 OM-M SCs成骨诱导分化的形态变化及茜素红S染色 经成骨诱导后的OM-MSCs，出现聚集的倾向，细胞密度较大，形态、边界不清晰。诱导3周后，进行茜素红染色后细胞内矿化结节呈现红色。说明OMMSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能（图2B、D）。

2.4 OM-M SCs的生长活性测定和细胞周期 细胞传代后，第1～ 2天处于增殖不明显。到第3～ 5天细胞进入对数生长期，细胞增殖加速，呈几何倍数增加。第6～7天则进入平台期（P<0.05，n=3）（图3），呈S型。第3代人OM-MSCs的细胞周期检测显示：G1期占82.47%，S 期占6.68%，G2期10.85%。提示大部分细胞处于静止状态，少部分细胞处于增殖期（图4）。

3 讨论

作为成体干细胞家族的重要成员之一，间充质干细胞具有自我扩增和多向分化特性。但是中胚层来源的MSCs如骨髓间充质干细胞具有向中胚层组织自然分化的趋势，在体外培养扩增的过程中随着年龄的增加其向神经分化的潜能逐渐减弱［2］。因此，找寻新的具有多向分化潜能且可用于自体移植的种子细胞已成为神经修复和组织工程研究领域的一个重要的研究热点。

OM-MSCs存在于嗅黏膜的固有层中，属于外胚层来源，不仅可分化为中胚层来源的组织，如骨组织和脂肪组织等，也可被诱导跨胚层分化为神经细胞和神经胶质细胞［13，14］，大量研究证明 ：OM-MSCs具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性及类似的免疫表型，而且在体外能够向脂肪细胞、成骨细胞、神经细胞、平滑肌细胞等分化，将嗅黏膜细胞植入鸡胚中，还能分化出典型的心脏，肌肉，肝脏，脑，脊髓等组织［5，15］。

图1 OM的获取及OM-MSCs在不同时期的形态特征

图2 嗅黏膜间充质干细胞表面标志物的表达

图3 油红O染色及茜素红染色

图4 OM-MSCs的生长曲线和细胞周期分析

本实验中通过利用嗅黏膜组织块贴壁法这一简单、可靠的方法，分离、纯化和扩增了OM-MSCs，采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基进行的嗅黏膜组织块贴壁法培养OM-MSCs，获得的细胞形态呈均一梭形，呈平行排列或漩涡状生长，经换液和传代等方法提纯细胞，细胞传至第3代时，可得到纯度较高的OMMSCs。通过流式细胞仪检测细胞标记物，发现OMMSCs高表达CD73、CD90，不表达CD34、CD45，符合间充质干细胞的流式检测一般特性。此外，为了证明鼻黏膜OM-MSCs 的多向分化能力，我们分别诱导OMMSCs向脂肪组织和骨组织定向分化。结果显示，在脂肪诱导剂培养后，OM-MSCs的细胞内形成可有油红O染色的脂滴；而在成骨诱导剂诱导培养后，OM-MSCs在细胞表面形成大量的茜草红染色阳性的钙结节。上述结果表明通过组织块贴壁法获得、分离、培养的OMMSCs具有间充质干细胞的一般细胞形态、细胞表型和分化能力。OM-MSCs的生长曲线符合正常细胞的生长特性。其倍增时间较短，平均为2~3天，说明分离培养获得的OM-MSCs在体外生长活跃，具有较强的增殖能力。细胞周期检测显示第3代人OM-MSCs的细胞周期检测显示：82.47%处于GO/ G1期，S 期占6.68%，G2期10.85%。提示OM-MSCs合成前期，仍保留自我更新和增殖能力，符合干细胞的细胞增殖特性。

综上所述，本实验通过简单的体外分离可建立一种有效地富集纯度相当高的OM-MSCs获取、分离、培养的方法，并通过流式细胞术检测所培养的细胞表达间充质干细胞的特异性表面抗原而不表达造血干细胞特异性抗原，通过分化诱导成骨细胞和脂肪细胞等，证实了实验分离培养的OM-MSCs为纯度高、增殖能力强、分化能力强，数量充足的种子细胞，为神经修复及干细胞临床应用提供稳定的种子细胞来源具有重要意义。

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