谌 思，粟艳林，李 悦，彭小宁

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410006；2.长沙市中心医院，长沙 410004）

人Grn 基因位于 17 号染色体 q21.32［1］，Grn 是一个蛋白质编码基因，具有生长因子活性和细胞因子活性。研究表明Grn基因在调节细胞生长、损伤修复和肿瘤的发生中起重要作用，并与额颞叶泛素化变性和失语症的发病有关。

本实验小组成员在前期工作中找到了在小鼠体内与Dnd1基因相互作用的基因，为了进一步研究与人Dnd1基因相互作用的基因，我们进行了人脑cDNA文库的筛选，找到了与之相互作用的四个基因，Grn就是其中之一［2］。为了进一步验证人Dnd1与Grn的相互作用，进行了人Grn的克隆与表达。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Grn引物合成于上海吉凯基因公司，质粒pGEX-4T-2和感受态细胞TOP10和DE3均由本实验室保存，THP-1细胞为同实验中心其他组成员正在培养的细胞，RNA提取试剂盒购于罗氏公司，逆转录试剂盒、用于PCR扩增的PCR高保真酶、dNTP、DMSO、用于质粒重组的限制性内切酶、抗GRN的单克隆抗体一抗鼠抗人，二抗羊抗鼠和DAB试剂盒均购于Thermo公司，DNA凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于康为世纪生物公司，琼脂粉、胰蛋白酶、甘氨酸、SDS、脱脂奶粉、甘油等试剂均购于上海生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的合成 参考Genbank里人GRN的cDNA序列，设计PCR引物，上游引物（含EcoRⅠ酶切位点GAATTC）：CCGGAATTCCGATGTGGACCCTGGTGAGC TGG，下游引物（含SalⅠ酶切位点GTCGAC）：ACGCGT CGACTCACAGCAGCTGTCTC- AAGGCTGG。由上海吉凯基因公司合成。

1.2.2 PCR获得目的基因片段 从EBI中查到Grn高表达的细胞包括THP-1，从THP-1细胞中提取RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板PCR扩增目的基因。PCR条件：98℃预变性2min；98℃变性20sec，57℃退火30sec，72℃延伸50sec，共32个循环；72℃延伸6min。1%琼脂糖凝胶分离与鉴定，切胶，DNA凝胶回收试剂盒回收Grn编码区片段。

1.2.3 pGEX-4T-2-G rn重组质粒的构建 分别用EcorⅠ和SalⅠ两种限制性内切酶双酶切pGEX-4T-2和Grn（表1），回收酶切后质粒和片段，T4连接酶4℃连接过夜，转化到TOP10感受态细胞中，转化步骤：

取150μL TOP10感受态细胞在冰上融化，加入连接好的质粒混匀，冰上放置30min，42℃热激90sec，再重新放到冰上2min，加入800μL LB培养基，至于摇床上37℃ 200r/min 1h，4℃ 8000r/min离心1min，将培养基倒掉，用残留的培养基悬浮，然后用移液枪将菌液加到氨苄抗性的LB平板上，用琼脂糖珠涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30min后，倒置培养过夜。挑取单克隆菌于氨苄抗性的5mL LB培养基中，37℃ 200r/min 3h，取菌液PCR，阳性克隆继续摇菌过夜，用质粒小提试剂盒提取pGEX-4T-2-Grn重组质粒，用EcorⅠ和SalⅠ两种限制性内切酶双酶切pGEX-4T-2-Grn重组质粒验证克隆结果，阳性克隆送公司测序。

表1 pGEX-4T-2质粒和Grn酶切反应体系

1.2.4 Grn蛋白表达 取测序成功的pGEX-4T-2-grn重组质粒转化到感受态细胞DE3内，涂板后37℃过夜，挑取单克隆菌落于氨苄抗性的5mL LB培养基中，37℃200r/min 摇菌10h后，按1∶200加入到氨苄抗性10mL LB培养基中扩大培养，37℃ 200r/m in 当OD值达到0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续摇菌5h，4℃8000r/min 离心5min，倒尽上清液，加入4倍体积 ddH2O与5×SDS-PAGE上样缓冲液，金属浴95℃ 10min。通过考马斯亮蓝染色和 Western blot分析结果，Western blot具体步骤：1.跑胶：取20mL上清行10%SDS-PAGE蛋白电泳，600V、10 mA；2.转膜：将蛋白转至PVDF膜，

转膜过程中冰浴，300V、200 mA，140min；3.封闭：将PVDF膜放入5%脱脂奶粉的封闭液中，并置于摇床上慢速摇动，于室温下封闭2h；4.一抗孵育：加入GRN单抗（1：500）检测GRN，4℃转钴过夜或37℃温箱僻育120m in；5.二抗孵育：用1×TBST洗膜3次（每次15min），然后用辣根过氧化物酶标记的抗体37℃ 孵育60min；6.显影：用1×TBST洗膜4次（每次l0min），随后用DAB试剂盒在化学发光仪下显影。

2 结果

2.1 PCR扩增G rn 以THP-1细胞cDNA为模板，用针对Grn编码区的特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖电泳分析结果，扩增出的1782bp左右的Grn编码区条带，与预期大小一致（图1）。

2.2 重组质粒pGEX-4T-2-Grn的鉴定 提取阳性克隆的重组质粒pGEX-4T-2-Grn，用EcorⅠ和SalⅠ两种限制性内切酶双酶切，经琼脂糖电泳分析结果，得到被切开的质粒和目的片段Grn（图2）。

图1 GRN PCR电泳图

图2 GRN 重组质粒双酶切图

2.3 pGEX-4T-2-G rn 插入序列测序结果 pGEX-4T-2-Grn 插入序列测序由上海博尚基因公司完成。测序结果通过NCBI网站blast与GenBank里的序列完全匹配（图3）。

2.4 通过Western blot鉴定pGEX-4T-2-Grn 目的基因蛋白表达 经过Western blot鉴定，转化了pGEX-4T-2质粒和pGEX-4T-2-Grn质粒的DE3感受态细胞中Grn蛋白的表达存在明显的差异（Grn目的蛋白大小为91KD，图4）。

3 讨论

GRN是一种分泌蛋白［3］，Progranulin是它的前体蛋白，分子量为88kDa。Progranulin又被称为proepithelin、PC cell-derived生长因子，这个信号肽分裂形成成熟的GRN。GRN又将继续被裂解成大小为6KD的活性肽，这些小的分裂后肽被称为granulin A，granulin B和granulin C等。granulin A与granulin B的作用等同于上皮蛋白1和上皮蛋白2。所有的这些小分子肽与完整的GRN都调节细胞生长。然而，GRN蛋白家族的不同成员对于细胞生长有不同的作用。例如：抑制因子，刺激因素。因此，Granulin家族在人类正常的生长发育，伤口愈合和肿瘤的发生中起到了巨大作用。

图3 GRN 重组质粒测序NCBI BLAST

图4 GRN 蛋白表达

近年来关于Grn基因的研究越来越多，发现它与许多疾病的发生有关系，Jacova等人发现Grn突变使得额颞叶的退化早于人群平均年龄［4］，而且还是阿尔茨海默病的危险因素之一［5］。Qiu等人发现在系统性红斑狼疮患者体内GRN前蛋白的表达上调［6］，同时，Jian等人的研究发现GRN前蛋白通过与TNF肿瘤坏死因子受体作用具有抗炎作用，前GRN蛋白的下调能引起自身免疫性疾病的发生［7］。另有Ungurs等人的研究表明COPD患者气道炎症的产生与前GRN蛋白的消化减少有关［8］等，由此可见Grn在维持人体的稳态和机体的正常运转存在着重要作用。但是目前关于Grn基因结构和蛋白之间相互作用的报道很少见，要想明确Grn的作用应该从它的基因结构、蛋白结构和蛋白相互作用的基础上从本质上来研究，成功重组人Grn的克隆和表达，是为研究Grn的作用做准备的。

Dnd1在人睾丸、肝脏、小脑组织中高表达，但Dnd1的生物学功能还未完全明确。重组质粒pGEX-4T-2-grn上带有GST标签，可通过GST PULL DOWN 技术，验证Grn和Dnd1在细胞外是否相互作用，并进一步通过免疫共沉淀研究蛋白在细胞内是否具有相互作用。这对于研究Dnd1信号通路及生物学功能，以及Dnd1突变致病机制具有重要意义。

［1］Lam MY, Heaney JD, Youngren KK. Trans-generational epistasis between Dnd1Ter and other modifier genes controls susceptibility to testicular germ cell tumors［J］. Hum Mol Genet, 2007, 16(18): 2233-2240.

［2］张菁, 罗畅, 丁小凤, 等. 小鼠Dnd1杂交系统诱耳载体的构建及自身激活检测［J］. 湖南师范大学学报（医学版）, 2008, 5(1): 1-4.

［3］Nguyen AD, Nguyen TA, Ceni KB, et al. Secreted. progranulin is a homodimer and is not a component of high density lipoproteins (HDL)［J］.J Biol Chem, 2013, 288(12): 8627-8635.

［4］Jacova C, Hsiung GY, Tawankanjanachot I, et al. Anterior brain glucose hypometabolism predates dementia in progranulin mutation carriers［J］.Neurology, 2013, 81(15): 1322-1331.

［5］Perry D C, Lehmann M, Yokoyama J S, et al. Progranulin mutations as risk factors for Alzheimer disease［J］. JAMA neurology, 2013, 70(6):774-778.

［6］Qiu F, Song L, Ding F, et al. Expression level of the growth factor progranulin is related with development of systemic lupus erythematosus［J］.Diagnostic pathology, 2013, 8(1): 88.

［7］Jian J, Zhao S, Tian Q, et al. Progranulin directly binds to the CRD2 and CRD3 of TNFR extracellular domains［J］. FEBS letters, 2013, 587(21):3428-3436.

［8］Ungurs M J, Sinden N J, Stockley R A. Progranulin is a substrate for neutrophil-elastase and proteinase-3 in the airway and its concentration correlates with mediators of airway inflammation in COPD［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2014, 306(1): L80-87.