肖 荞，孙姝雯，崔迎红，曹晓正，曹建国

（湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

索拉菲尼（sorafenib，SO）是现今一线治疗肝细胞癌的一种多激酶抑制剂。有研究证实SO通过阻断RAF/MEK/ERK通路诱导肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞凋亡［1］。然而，肿瘤干细胞由于组成性活化核因子κB（nuclear factors κB，NF-κB）耐受 SO 诱导细胞凋亡［2］。研究证明8-溴-7-甲氧基白杨素（8-bromo-7-methoxychrysin，BrMC）通过促进ROS生成和ROS依赖持续性JNK活化诱导人HCC细胞凋亡［3］。我们新近研究证实BrMC具有靶向抑制肝癌干细胞特性和功能作用［4，5］。本文研究BrMC是否具有增强SO诱导SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡作用，并探讨其作用机制是否涉及下调NF-κB蛋白表达。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌细胞系（SMMC-7721）购于中国科学院上海细胞生物研究所（中国上海市）。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2混合气体，95%饱和湿度的培养箱内培养和扩增。取对数生长期细胞用于实验。

1.2 SMMC-7721细胞系干细胞条件培养基悬浮培养及肿瘤球形成细胞传代培养

1.2.1 SMMC-7721细胞系干细胞条件培养基悬浮培养 取对数生长期SMMC-7721细胞系细胞，消化成单细胞悬液，800 r/min离心5min去血清，弃上清，加入PBS洗涤1~2次，离心后以干细胞条件培养基（添加100IU/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、2% B27、0.4% BSA和4μg/mL 胰岛素的DMEM/F12培养基）悬浮培养于超低粘附6孔细胞培养板中，每孔接种细胞数为5000个。每隔2天加入新鲜干细胞条件培养基1mL直至第4天，球体达到50μm直径大小。

1.2.2 肿瘤球形成细胞的传代培养 收集上述球体达到50μm直径大小的肿瘤球形成细胞，600r/min离心5min，小心吸弃上清，加入0.05% EDTA-胰蛋白酶消化3min，加入干细胞培养基终止消化后，机械分散细胞呈单细胞悬液，800r/min离心5min去除胰蛋白酶，计数，重新在干细胞条件培养基中悬浮培养。

1.3 细胞凋亡检测 为了研究SO、BrMC及两者合用对SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的影响。以每毫升 5×105个细胞数接种至超低粘附6孔培养板中培养，每孔2mL。不同浓度SO（2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L 和 50μmol/L）和 BrMC（10μmol/L）分别单独处理作为对照，两者合用包括2.5μmol/L SO+10μmol/L BrMC、5μm ol/L SO+10μm ol/LBrMC、10μmol/L SO+10μmol/L BrMC、50μmol/L SO+10μmol/L BrMC添加到培养基中。培养24h，收集各组干细胞样细胞用细胞凋亡检测试剂盒（A211-01型，唯赞生物）处理后，进行流式细胞仪（C6型BD流式细胞仪，美国）分析。激发波长为488 nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2通道检测。用CellQuest等软件进行分析；绘制散点图，FL1为横坐标，FL2为纵坐标。每个样本至少采集10000个细胞进行检测。

1.4 W estern b lot分析 处理的细胞以PBS冲洗一遍，加入1mL裂解酶缓冲液（50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40、10% 丙三醇、1M β-Me、1μg/mL抑肽酶、0.5μg/mL抑酶醛肽、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF及蛋白酶抑制剂）孵育30min，刮取并收集细胞。细胞裂解液经13 200×g，4℃ 条件下离心5m in，制备全细胞总蛋白提取物。Bradford试验（Bio-Rad Laboratories，Hercule s，CA）测定蛋白质含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，并转移至PVDF膜。在PBST中以脱脂牛奶5%（w/v）对PVDF膜进行封闭随后以鼠抗人NF-κB（p65）单克隆抗体作为一抗孵育，轻微震动下，4℃条件下过夜。冲洗膜四次，以过氧化物酶标记的二抗孵育上述PVDF膜1h。用增强化学发光试剂盒（Amersham Biosciences）对信号进行检测。

2 结果

2.1 人肝细胞癌SMM C-7721细胞系成球培养与我们先前发表文献［4，5］的结果一致，人肝细胞癌SMMC-7721细胞系干细胞条件培养基超低粘附板培养能得到肿瘤球形成细胞，并可连续传代培养和扩增（图1）。

图1. 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肿瘤球倒置相差显微图像（×40）

2.2 BrMC增强SO诱导SMMC-7721细胞系球形成细胞凋亡作用 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术分析结果证明，BrMC（10.0μmol/L）和SO（2.5、5.0、10.0和50.0μmol/L）分别单独处理SMMC-7721细胞系球形成细胞24h轻度诱导细胞凋亡（图2）；SO（2.5、5.0、10.0和 50.0μmol/L）分别联合 BrMC（10.0μmol/L）处理协同性诱导细胞凋亡（图2）（P<0.05）。

2.3 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系球形成细胞高表达 NF-Κb（p65）蛋白 Western blot分析结果显示 ：与亲本细胞相比，人肝细胞癌SMMC-7721细胞系球形成细胞NF-Κb（p65）蛋白高表达（图3）。

图2 BrMC、SO以及两者合用对SMMC-7721细胞系球形成细胞凋亡的影响。与溶媒（0.1% DMSO）对照组比较，*P<0.01；与相同浓度SO单独处理组比较，＃P<0.05。SO：索拉菲尼，BrMC：8-溴-7-甲氧基白杨素。

图3 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系球形成细胞与亲本细胞NF-κB（p65）蛋白表达的比较

2.4 BrMC、SO以及两者合用对SMMC-7721细胞系球形成细胞NF-Κb（p65）蛋白表达的影响 Western Blot分析结果表明：：SO和BrMC联合应用相比于SO或BrMC单用的对照组有更明显地抑制凋亡抗性蛋白NF-κB（p65）表达的作用（图4）。

图4 SO、BrMC及两者合用对SMMC-7721细胞系球形成细胞蛋白NF-κB（p65）表达的影响

3 讨论

干细胞条件培养基悬浮培养法是基于肿瘤干细胞具有失巢性凋亡抗性的性质富集和分选肿瘤干细胞的一种有效方法。其原理如下：干细胞条件培养基悬浮培养法是在无血清的条件下，添加成分完全明确的生长因子代替血清，使其既满足细胞生长需要，同时又避免血清的诱导分化问题［6］。在本研究中，我们以干细胞条件培养基悬浮培养法富集SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞，证实肿瘤细胞呈非粘附性克隆球生长（图1）。提示：本研究中以干细胞条件培养基悬浮培养法富集球形成细胞具有干细胞样细胞特性。

BrMC是白杨素的一种衍生物。已有研究表明BrMC诱导肝细胞癌细胞凋亡和靶向抑制肝癌干细胞特性和功能［4，5］。SO也能通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导途径，降低elF4E的磷酸化水平，下调抗凋亡蛋白Mcl1的表达，从而诱导肝癌细胞系细胞凋亡［2］。本研究使用细胞凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪分析发现：SO与BrMC联合用药组诱导SMMC-7721细胞系球形成细胞凋亡率高于各药单独用药组诱导凋亡率之和，这些结果提示BrMC能有效增强SO诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡作用（图2）。

在胰腺神经内分泌肿瘤，成胶质细胞瘤和乳腺癌的小鼠模型最近的研究表明，SO和相关的抗血管生成物质在初始抗肿瘤作用后，显示出增强肿瘤进展和增加转移发生的作用［7，8］。潜在机制可能是由于抗血管生成治疗导致缺氧诱导，并选择高度耐药肿瘤干细胞适应氧气和营养物质耗竭。在各种恶性肿瘤，包括胰腺癌和高度治疗耐受的胰腺肿瘤细胞中可以观察到NF-κB过表达［9，10］。我们的研究结果首次表明：与亲本细胞相比，SMMC-7721细胞系球形成细胞NF-κB（p65）蛋白高表达（图3）。值得注意的是，我们的结果证实：BrMC与SO合用协同性下调SMMC-7721细胞系球形成细胞NF-κB（p65）蛋白表达（图4）；提示：BrMC增强增强SO诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡作用可能涉及其协同下调NF-κB（p65）蛋白表达和抑制NF-κB活性。

总之，本文的实验研究证实BrMC和SO具有诱导人肝细胞癌SMMC-7721球形成细胞凋亡作用，两者合用就协同效应。BrMC与SO联合应用能协同性下调下调NF-κB（p65）蛋白表达。为临床联合应用BrMC和SO治疗肝细胞癌提供了实验依据。

［1］Liu L, Cao Y, Chen C, et al. Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway, inhibits tumor angiogenesis, and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5［J］. Cancer Res., 2006,66(24): 11851-11858.

［2］Rausch V, Liu L, Kallifatidis G, et al. Synergistic activity of sorafenib and sulforaphane abolishes pancreatic cancer stem cell characteristics［J］.Cancer Res. 2010, 70(12): 5004-5013.

［3］Yang XH, Zheng X, Cao JG, et al. 8-Bromo-7-methoxychrysin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells involves ROS and JNK［J］.World J Gastroenterol, 2010, 16(27): 3385-3393.

［4］Ren KQ, Cao XZ, Liu ZH, et al. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling［J］. Int J Oncol, 2013, 43(5): 1719-1729.

［5］Quan MF, Xiao LH, Liu ZH, et al. 8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of β-catenin［J］.World J Gastroenterol, 2013, 19(43): 7680-7695.

［6］冷超, 韦兵, 莫靓, 等. 白杨素抑制肺癌A549细胞系球形成细胞自我更新［J］. 湖南师范大学学报(医学版), 2014, 11 (3): 1-4.

［7］Paez-Ribes M, Allen E, Hudock J, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis［J］. Cancer Cell, 2009, 15(3): 220-231.

［8］Ebos JM, Lee CR, Cruz-Munoz W, et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis［J］.Cancer Cell 2009, 15(3): 232-239.

［9］Chandler NM, Canete JJ, Callery MP. Increased expression of NF-κB subunits in human pancreatic cancer cells［J］. J Surg Res, 2004, 11(1):9-14.

［10］Arlt A, Gehrz A, Muerkoster S, et al. Role of NF-κB and Akt/PI3K in the resistance of pancreatic carcinoma cell lines against gemcitabineinduced cell death［J］. Oncogene, 2003, 2(21): 3243-3251.