杨 智，金 一，沙小松 ，钟 维 ，彭耀铭，金 红

（1. 湖南师范大学医学院，长沙 410013；2. 湖南师范大学树达学院医学系，长沙 410013）

黄芪为益肾通络方复方［1］中的一味君药，在该方中起补气升阳的作用，为治疗气虚浮肿之要药。为了明确黄芪在该复方中的作用机理我们采用单次尾筋脉注射盐酸多柔比星注射液7mg／1kg造模方法［2-4］，建立阿霉素肾病（adriamycin-induced nephropathy，ADRN）模型，观察黄芪对肾组织中Smad4的影响，探讨黄芪对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 8周龄，体重180～200g之间的SPF级Sprague Daw ley（SD）大鼠，购自长沙市开福区东创实验动物科技服务部，生产许可证号：SCXK（湘）

2009-0012。

1.2 药物和试剂 注射用盐酸多柔比星（浙江海正药业股份有限公司111201）总蛋白测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司20121102）；β-actin多克隆抗体（博士德生物公司），兔抗Smad4 多克隆抗体（CST），全自动生化分析仪（Olympus AU400）。

1.3 模型建立及试验分组，给药 将21只大鼠随机分为3组，分别为空白组、ADRN造模组、黄芪治疗组。造模组将注射用盐酸多柔比星用生理盐水溶解为2mg/mL，大鼠一次尾静脉注射盐酸多柔比星7mg/kg，空白组和黄芪治疗组仅注射等量生理盐水。然后标准条件下再饲养三周，总共需要四周，然后收集24h尿液并测定24h尿蛋白（hupro）。造模大鼠出现大量蛋白尿时视为造模成功。随后黄芪组每天灌服1mL/100g黄芪汤剂（由单味药黄芪经煎煮浓缩至0.28g/mL），空白组和ADRN组每天灌服1 mL/100g蒸馏水，每天灌服一次，连续三周。

1.4 指标检测 检测模前、灌药前、灌药后24h尿蛋白，灌药后第八周大鼠眼眶后静脉丛取血后摘取肾脏分别进行血液标本和肾组织的各项指标检测，免疫印迹（western blot）检测肾组织Smad4。

1.5 统计学处理 实验所得数据以mean±SD表示，采用SPSS 17.0进行数据分析，组间比较用单因素方差分析；western结果用Image Pro软件分析灰度后进行数据归一化处理，用Bartlett检验方差齐性，然后进行方差分析和Tukey多重比较。

2 结果

2.1 各组生化指标 由表1可见，模前24huPro测定结果显示，其含量均小于5mg/24 h，差异无统计学意义（P>0.05）,提示6组模前24huPro测定结果具有可比性；灌前24huPro测定结果显示，除空白组含量小于5mg/24h外，其他组含量均大于200mg/24h，提示造模成功；灌胃后，24huPro、血Scr及BUN模型组与空白组相比均明显增高（其中24huPro 和BUN P<0.01，Scr P<0.05），治疗组与模型组相比下降明显（P<0.01）；而ALB模型组低于空白组织（P<0.01），治疗组高于模型（P<0.01）。

表1 各组生化指标比较

2.2 病理学检查 大鼠肾小球在光学显微镜水平下的观察（图1）：（1）空白组：肾小球出现正常（HE染色;放大倍数10×40）。 （2）造模组1：肾小球，鲍曼囊增厚（HE染色；放大倍数10×40）。（3）造模组2：在泌尿空间出现玻璃样的肾小球和严重的毛细血管扩张（HE染色;放大倍数10×40）。（4）黄芪组：肾小球损伤较空白组有一定损伤，较模型组则有修复（HE染色；放大倍数10×40）。

图1 大鼠肾脏病理检查结果（HE染色）

2.3 对肾组织Sm ad4表达的影响 结果显示Smad4在造模组肾组织中的表达明显高于空白组和黄芪组，而黄芪组较造模组表达有明显下降（P<0.01）。见表2，图2。

表2 3组大鼠Smad4蛋白表达情况

图2 肾组织中Smad4蛋白表达

3 讨论

益肾通络方为一个中药复方, 主要针对肾病综合症肾虚夹瘀的病机特点，以补肾化阏为主要治法进行处方用药，其中黄芪作为益肾通络方的一味君药，有补气固表、利尿托毒的功效，可用于治疗气虚水肿、慢性肾炎蛋白尿［5］等，已被大量应用于临床辅助治疗肾病。本实验结果表明黄芪汤剂可显著升高阿霉素造模大鼠ALB，降低24尿蛋白定量、BUN、Scr，改善肾功能。在前期的研究［6-7］中我们已经找到有效控制黄芪在该复方中质量的方法，并将其视为一种主要的复方质量检测指标。

肾纤维化是所有慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的共同病理过程，研究表明［8］转化生长因子-β1(TGF-β1)是最主要的致纤维化因子。Smads作为TGF-β1的下游信号传导蛋白，根据其结构和功能不同可分为3个亚家族，其中Smad4是共同通路型Smad（Co-Smad），TGF-β/Smads信号通路中的信号由细胞核外进入核内要借助于Smad4的核转运功能，Smad4通过与磷酸化的R-Smads结合成复合物，在Smads信号传导通路中起着信号的正向传导放大作用，Smads蛋白的生物效应都是在Smad4的参与下与其他Smad蛋白互相配合而完成。在本实验中，黄芪灌胃后Smad4在肾组织中阳性表达明显降低，提示黄芪可能通过影响Smad4的表达直接参与TGF-β1抑制肾组织纤维化进展。

黄芪有利尿消肿、防止或逆转尿蛋白的作用，现代研究也证明黄芪能抑制致纤维化细胞因子［9］，这应该是本实验所研究通过影响Smad4的表达进而抑制肾组织纤维化、硬化过程的结果，然而现代研究证明黄芪含有黄芪皂苷、黄芪多糖、黄芪黄酮类化合物等成份［10］，究竟是某种成分单独作用的结果还是多种成分共同作用的结果还有待进一步研究。

［1］杨智, 向爱国, 金红, 等. 中药复方对肾病综合片大鼠肾功能影响的实验研究［J］. 湖南中医杂志. 2007, 23(2): 82-83.

［2］Boonsanit D, Kanchanapangk S, Brranakarlc C. L-carnitine ameliorates doxorubicin-induced nephroticsyndrome in rats［J］. Nephrolgy(carlto),2006, 11(4)313-320.

［3］蔺建军, 杨勇, 高娜, 等. 阿霉素注射次数及剂量对肾病综合征模型的影响［J］. 中国中西医结合肾病杂志. 2011, 12(8A): 676-678.

［4］张勇, 张蓓, 宁华英, 等. 单次尾静脉注射法阿霉素大鼠肾病模型的建立［J］. 中国实验动物学报, 2013, 21(1A): 1-4.

［5］国家药典委员会. 中国药典（2010版, 第1部）. 北京: 中国医药科技出版社, 2010.

［6］凌晓, 金红, 杨智, 等. 益肾通络方中黄芪甲苷的含量测定［J］. 湖南中医杂志, 2013, 29(2): 119-121.

［7］金红, 李雅, 凌晓, 等. 健康大鼠服用益肾通络方后血清中阿魏酸的RP-HPLC测定. 湖南师范大学学报(医学版), 2007, 4(4): 9-10, 13.

［8］武贵群, 高翔, 梅长林. TGF-β/Smads通路与肾脏纤维化研究进展［J］. 中国中西医结合肾病杂志, 2012, 13(5): 459-461.

［9］陈晶, 张博华. 黄芪、大黄的抗肾纤维化作用研究进展［J］. 中医药学报, 2011, 39(6): 101-104.

［10］温燕梅. 黄芪的化学成分研究进展［J］. 中成药, 2006, 28(6): 881-883.