唐吉思，布日额，吴金花，孙立杰，薛晓阳，刘 洋，丁 铲

(1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028043；2.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽028043；3.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241)

牛乳腺炎(Bovine mastitis)是影响牛乳业发展的最主要奶牛疾病之一，该病不仅给乳业造成严重的经济损失，而且也是造成乳品污染和引起中毒的主要因素之一，防治该病具有重要的公共卫生学意义[1-2]。由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的奶牛乳腺炎占牛乳腺炎病例的50%左右[3]，该致病菌产生耐热性强金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcus aureusenterotoxin，SE)，引起食物中毒，研究表明人体摄入1 μg SE即能引起中毒[4]。其产生的SE有A、B、C、D、E、G、H及 I等 8种[5-7]。其中SEA和SEB经100℃2 h才能够被破坏，目前乳品生产工艺中的灭菌条件均不能使其灭活或破坏，因此造成严重的安全隐患。建立一种快速、定量检测原料乳中S.aureusSEA基因的方法，对保障乳制品的安全具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 菌株及试剂 产SEA的S.aureus(ATCC13565)标准菌由东北农业大学乳品中心惠赠；其它参考菌为产 SEB的S.aureus(CMCC 26074)、产 SEC的S.aureus(CMCC 26075)、无乳链球菌(CIVDC 1886，C55901)、大肠杆菌(CICC 10389)、嗜热链球菌(CICC 6063)、伤寒沙门氏菌(CMCC 50071)等均购自中国兽医药品鉴定所；大肠杆菌DH5α及JM109、TaqDNA聚合酶、dNTP、PCR buffer购自宝生物工程(大连)有限公司；3株产SEAS.aureus为本实验室分离鉴定；pGEM-T easy载体、染料SYBR GreenⅠmix购自广东东盛生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；DNA回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 目的基因扩增

1.2.1 细菌培养 将S.aureus于营养琼脂培养基上划线培养，37℃过夜，挑取单菌落接种于营养肉汤培养基，37℃过夜培养后待用。

1.2.2 细菌基因组DNA的提取S.aureus基因组DNA的提取采用常规氯仿异戊醇抽提方法。其它菌株采用煮沸法提取基因组DNA。

1.2.3 牛奶中S.aureus基因组DNA的提取 取等体积的无水乙醇∶氨水∶乙醚(1∶1∶1)混合液加入到人工污染S.aureus的新鲜牛奶样品中，混匀，12 000 r/min 10 min，弃去上层，氯仿异戊醇抽提方法提取S.aureus基因组DNA。

1.2.4 引物设计 根据GenBank中登录的牛源S.aureusSEA基因序列(EF520720.1)，采用软件Primer5.0和Oligo 6设计引物，该引物扩增片段长度为101 bp。上游：5'-CTGTTCAGGAGTTGGATCT T-3'， 下 游 ： 5'-GATTAATCCCCTCTGAACCT-3'。 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.3 标准曲线的建立

1.3.1 荧光定量PCR标准模板的制备 将提取的S.aureus基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收。将回收片段与pGEM-T easy载体连接，转化感受态E.coliDH5α，提取重组质粒，用PCR方法和酶切鉴定的阳性克隆质粒命名为pGEM-SEA，由上海生工生物技术服务有限公司测序，对测序结果分析。

1.3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立及灵敏度的确定 将标准品重组质粒测定OD值，10倍梯度稀释后作为模板进行荧光定量PCR，确定标准曲线以及灵敏度。并使用以下公式计算拷贝数：拷贝数/mL=6.02×1023次(拷贝数 /mol)×浓度(g/mL)/MW(g/mol)。

1.4 特异性检测 对提取的产SEA的S.aureus标准株、本实验室分离鉴定的产SEA菌株、产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5α及JM109及临床分离并鉴定的2株大肠杆菌基因组DNA进行荧光定量PCR扩增。反应体系为50 μL。荧光定量 PCR反应条件：94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，40个循环。在上述步骤后增加60℃至95℃的融解曲线分析。

1.5 人工模拟污染牛乳样品的检测 将已知浓度的菌液人工污染于乳中，并进行10倍梯度稀释，根据平板计数选取7个稀释梯度(2×101cfu/mL～2×107cfu/mL)，提取牛乳中金黄色葡萄球菌的基因组DNA作为模板进行荧光定量PCR，检测该方法的灵敏度。同时与常规PCR检测比较。

2 结 果

2.1S.aureus标准模板的制备结果 采用紫外分光光度计检测S.aureus基因组DNA的OD260nm/OD280nm值为1.8。构建pGEM-SEA重组质粒作为标准模板，序列分析的结果显示，扩增的临床分离菌株SEA基因与标准菌株(ATCC13565)同源性达到100%，与GenBank登录的相应序列(EF520720.1)比对结果其基因核苷酸相似性为99.0%。

2.2 荧光定量PCR的标准曲线和灵敏度 标准品pGEM-SEA重组质粒的初始拷贝数为1.65×109拷贝数/mL，经10倍梯度稀释，分别以稀释后的1.65×108拷贝数/mL～1.65×101拷贝数/mL作为模板，进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，确定灵敏度(图1)。

2.3 荧光定量PCR特异性试验结果 以13株菌株DNA为模板进行荧光定量PCR扩增。其中产SEA的S.aureus标准菌株(ATCC13565)的扩增曲线的Ct值为13，产SEA的S.aureus分离株的扩增Ct值为19左右，均在25以内。而对其它菌株扩增的Ct值均接近30或大于30，为阴性结果(图2)。特异性融解曲线Tm值为78.2℃～78.5℃，符合荧光定量PCR的融解曲线呈现单一峰形(图2)。

采用软件Realplex分析数据，结果表明建立的标准曲线的相关系数达到了0.99，并且标准曲线的斜率为-3.358，在灵敏度的平行试验中，3次平行试验的相关系数分别为0.98、0.99和0.99，达到了荧光定量PCR标准曲线的要求。在1.65×102拷贝数/mL的每次平行试验均有较好扩增，而1.65×101拷贝数/mL进行扩增时其Ct值大于水的Ct值，故该浓度下不能对SEA基因进行有效的检测，根据相关文献计算金黄色葡萄球菌基因组大约是3 fg[8]，计算出检测限为49.5 fg。

2.4 人工模拟污染牛乳样品的检测 提取7个稀释度污染牛乳中S.aureus的基因组DNA进行样品检测。结果表明2×102cfu/mL以上浓度的检样3次平行实验均为有效的扩增，2×101cfu/mL浓度检样无有效扩增，所以确定灵敏度为2×102cfu/mL(图3)。常规PCR检测结果灵敏度显示为2×104cfu/mL(图4)。

3 讨 论

随着人们生活水平的不断提高，人们对于牛乳以及相关乳制品的需求也越来越大，而原料乳虽然经过加工中的热处理，但葡萄球菌的肠毒素很难消除，从而对人类造成潜在的危害[9]。因此建立快速检测原料乳中产SEA的S.aureus的新型方法，对保证食用者的安全具有重要的意义。

本实验设计的使用SYBR GreenⅠ染料的荧光定量PCR方法对携带SEA基因的S.aureus进行检测，标准曲线相关性都达到0.98～0.99，灵敏度达到16.5拷贝/mL，即其灵敏度水平为49.5 fg。在确定牛乳中S.aureus检测灵敏度时，因为SEA基因是由S.aureus含有的温和噬菌体所编码[10]，所以并不能准确的确定某单一金葡菌细胞中的SEA基因的拷贝数，从而导致不能够通过细菌数和拷贝数的换算来确定牛乳中金葡菌的菌数，所以使用国内外通用的稀释菌液人工污染牛乳的方法来测定细菌数量的检测限，本实验结果检测限为2×102cfu/mL，比常规PCR方法灵敏度稿100倍。

本研究建立的荧光定量PCR方法快速，具有良好的特异性和灵敏度，比TaqMan探针法相比成本低，过程简捷，能够满足乳品行业对原料乳进行质量检测的需要，同时为乳品质量管理部门预警性监测提供了有效的技术支撑。

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