冯兆森，王华伟，方 育

(昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650032)

线粒体通过氧化呼吸链产生高达90%的细胞能量，是重要的细胞器。线粒体除有氧氧化供能外，还参与其他关键的细胞内过程，如维持钙稳态，触发凋亡性细胞死亡以及调节活性氧(reactive oxygen species,ROS)的代谢。上述线粒体功能的正常运作依赖于正常的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)，人类的mtDNA是个双链DNA分子，两条链分别称为重链(H)和轻链(L)，结构为闭合的环状。MtDNA相对独立于核基因组，参与编码4种呼吸酶复合物。由于mtDNA没有结合组蛋白、DNA修复系统效率低下，mtDNA容易受到致病因素损伤发生突变，影响线粒体的正常功能。线粒体功能的运作不仅依赖于正常的mtDNA分子，还与细胞中mtDNA拷贝数息息相关。MtDNA拷贝数即mtDNA分子的复制数量，不同的组织细胞根据各自的能耗需求，具有相适应的拷贝数，与细胞能耗需求呈正比，在病理情况下拷贝数可能发生变化。目前研究发现部分病变组织mtDNA拷贝数发生了改变，且与疾病发生机制密切相关。另外，mtDNA拷贝数对于预测疾病发病风险及预后具有价值。下面，本文将对mtDNA拷贝数变异机制及其影响疾病的机制进行论述。

1 MtDNA的复制过程

哺乳动物mtDNA通过线粒体中唯一的DNA聚合酶γ(polymerase γ，Polγ)进行复制和修复。人类的Polγ全酶分为催化亚基和辅助亚基，二者组成二聚体。催化亚基具有DNA聚合酶、3'-5'核酸外切酶和5'脱氧核糖磷酸裂解酶活性；辅助亚基为Polγ与mtDNA紧密结合所必需。Polγ全酶与具有mtDNA解旋酶活性的Twinkle蛋白以及mtDNA单链结合蛋白(mtSSBP)结合，形成mtDNA复制体。另外，具有5'-3'核酸外切酶活性的线粒体基因组维持外切酶1(mitochondrial genome maintenance exonuclease 1，MGME1)亦参与mtDNA复制[1]。根据mtDNA复制的链置换模型，两条链均以连续单向的方式异步复制。复制从两条链各自的起点开始的：重链(H)起点OriH和轻链(L)起点OriL，复制从OriH开始合成先导H链。随着新生的H链延长，亲代H链逐渐成为单链。复制大约11kb后，复制体到达OriL，L链以单链H链为模板并沿相反方向进行合成。H和L链DNA合成不断进行，直到形成两个完整的子分子。

2 MtDNA拷贝数变异与氧化应激相关

目前研究普遍认为病变组织中mtDNA拷贝数变异与ROS产生增多关系密切。与对照组相比，外周动脉疾病患者外周血mtDNA拷贝数下降[2]；糖尿病患者外周血mtDNA拷贝数降低[3]；哮喘患者外周血mtDNA拷贝数升高[4]；类风湿关节炎受累双胞胎及其未受累双胞胎与对照组健康双胞胎相比，外周血mtDNA拷贝数减少。这些疾病中mtDNA拷贝数变异均被认为是疾病发生过程中致病因素引起ROS产生增加导致，如高血糖、空气致敏原等破坏线粒体呼吸链复合物，导致ROS产生增多。哮喘患者血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降，无法有效代谢ROS，糖皮质激素治疗使SOD活性恢复至健康水平，并且糖皮质激素的使用与哮喘患者mtDNA拷贝数呈显著负相关[4]。由此有充分的理由相信mtDNA拷贝数的增加是由于ROS增多导致。

3 MtDNA拷贝数变异机制

ROS主要产生于线粒体内膜，在正常情况下，线粒体产生的ROS能及时清除，当暴露于致病因素超过临界值，ROS大量产生，导致mtDNA受到氧化损伤。MtDNA的控制区域称为D环区(displacement loop，D-Loop)，与mtDNA的其他区域相比，D-Loop对氧化损伤高度敏感。其中位于303和315核苷酸之间的多胞嘧啶区称为D310区，D310区的第一个多胞嘧啶重复序列(Poly-C链)，在健康人群中其C残基数量分布范围为7C-9C，Poly-C链中C残基数量的改变影响Polγ与其他反式作用元件的结合，影响mtDNA复制，目前已在多种恶性肿瘤组织中发现D310区突变，并且是恶性肿瘤mtDNA中最常见的突变。Polγ对氧化损伤较mtDNA更为敏感，ROS会抑制该酶活性并降低其与mtDNA亲和力，并使其复制效率下降、复制过程容易出错，导致mtDNA容易发生突变，D310区C残基数目发生改变[5]。即氧化损伤使mtDNA损伤进入恶性循环，一方面使Polγ复制mtDNA时容易发生突变，另一方面，突变的mtDNA与Polγ亲和力下降，效率降低，但在正常情况下，轻度损伤的mtDNA可通过mtDNA修复机制进行修复。

线粒体已被证明可通过复制mtDNA增加其拷贝数来代偿损害和功能障碍：轻度氧化损伤时，为了代偿减弱的氧化磷酸化及其他线粒体功能，mtDNA复制转录系统活性增加，加强mtDNA的复制引起拷贝数增加。在此过程中抑癌基因TP53有着重要作用：TP53通过下游基因P53R2调节线粒体生物合成功能，TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)减少ROS的产生，对mtDNA形成保护作用[6]。ROS含量增加时，P53蛋白能定位、转移到线粒体，与Polγ相互作用，增强 Polγ的合成功能，增加mtDNA拷贝数以代偿损伤的线粒体功能[7]。因此轻度氧化应激导致mtDNA拷贝数代偿性增加，而当氧化损伤超过mtDNA损伤修复系统代偿能力时，mtDNA严重损伤，发生广泛突变，触发线粒体自噬机制[8]，清除功能障碍的线粒体，引起mtDNA拷贝数下降。

MtDNA拷贝数变异除与ROS损伤有关外，还与基因突变高度相关，mtDNA的合成一定程度上受到核基因的控制，核基因的突变同样影响mtDNA拷贝数。以mtDNA拷贝数严重减少为特征的一组疾病mtDNA耗竭综合征(mitochondrial DNA depletion syndrome，MDS)便是由核基因突变引起，这些突变基因包括：TK2、SUCLA2、SUCLG1、C10orf2、TYMP(详见表1)[9]。这些基因的产物参与核苷酸合成以及mtDNA复制，突变后导致mtDNA合成发生障碍，mtDNA拷贝数减少。前文已经叙述了野生型TP53基因在维持mtDNA稳定上具有重要价值，而TP53发生突变则会导致mtDNA拷贝数下降。对食管鳞癌研究发现：P53蛋白倾向于在mtDNA拷贝数降低的组织中表达。由于野生型P53半衰期短，降解迅速，难以检出，所以组织中阳性表达的P53蛋白通常为而半衰期延长的突变型蛋白，由此提示mtDNA拷贝数减少与突变型P53蛋白的表达关系密切。其原因可能如前文所述，突变型P53蛋白无法通过P53R2、TIGAR等通路调控ROS稳态，导致mtDNA广泛损伤；无法与Polγ等因子相互作用，导致mtDNA拷贝数复制效率下降、容易出错，并最终触发线粒体自噬机制导致拷贝数减少。

表1 MDS中引起mtDNA拷贝数减少的常见突变位点

4 MtDNA拷贝数影响疾病发病风险及预后机制分析

现有研究发现mtDNA拷贝数变异与多种常见临床疾病发病风险以及预后具有相关性。较高的外周血mtDNA拷贝数人群具有较低的心血管疾病风险以及较低的糖尿病发病风险和较晚的发病时间[10]。预后方面，周围动脉疾病患者全因死亡率、心脑血管事件的风险随mtDNA拷贝数降低而增高；糖尿病患者外周血mtDNA拷贝数随并发症严重程度下降。对肿瘤的研究发现：外周血mtDNA拷贝数升高，患癌风险增加[11]；外周血mtDNA拷贝数升高患者预后不良[12]。总体看来，外周血mtDNA拷贝数上升患癌风险增加、预后变差。

外周血mtDNA主要来源于白细胞，外周血mtDNA拷贝数可能影响着免疫细胞的状态。对肿瘤患者的研究表明，外周血mtDNA拷贝数增加的患者表现出较强的免疫抑制，血液中较高的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞比例，白介素-2(interleukin 2，IL-2)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)浓度升高，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)浓度下降[13]。表明免疫细胞受到致病因素影响，mtDNA拷贝数升高，免疫系统受到抑制。而外周血mtDNA拷贝数降低的健康人群，血浆超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、纤维蛋白原和白细胞计数升高，说明外周血mtDNA拷贝数降低时机体处于轻度炎症状态[14]。我们已经熟知免疫损伤机制在糖尿病、外周动脉疾病(动脉粥样硬化引起)、类风湿性关节炎等疾病的病理生理学过程中起着重要作用，如1型糖尿病胰岛B细胞遭到自身免疫攻击破坏；2型糖尿病胰岛素抵抗等与免疫损伤密切相关；动脉粥样硬化中巨噬细胞入侵血管内膜组织被认为是动脉粥样硬化发生的关键始动因素；类风湿性关节炎则是典型的自身免疫性疾病。因此，我们认为外周血mtDNA拷贝数下降越多，免疫系统将处于更高的激活状态，导致这类疾病病变组织遭受更严重的免疫损伤。在恶性肿瘤中，外周血mtDNA拷贝数升高，免疫系统活性下降可能导致肿瘤细胞无法及时识别、清除，从而使患癌及复发风险增高。

实体组织mtDNA拷贝数变异同样值得关注，实体组织mtDNA拷贝数变化与癌症预后的关系较复杂，目前没有确切的结论。食管鳞状细胞癌患者癌组织mtDNA拷贝数降低者预后差，而喉癌预后不良的患者癌组织mtDNA拷贝数却明显升高[15]。如前文所述，mtDNA拷贝数升高代表着mtDNA损伤、线粒体功能障碍，这与癌症发生有关。MtDNA拷贝数变化与肿瘤预后关系不一致，可能是由于不同细胞具有不同的基础拷贝数，这种差异导致不同细胞mtDNA发生损伤至发生拷贝数下降的临界点不同，于是表现为不同类型的肿瘤中mtDNA拷贝数与肿瘤预后关系不一致的现象，但目前没有明确的结论，其中具体机制需要进一步研究。

5 结语与展望

近年来，多种病变组织中mtDNA拷贝数被发现发生变异，mtDNA拷贝数变异机制的研究逐渐成为研究疾病发生发展的热点。MtDNA拷贝数的变异机制对于解释致病因子对细胞的损伤机制提供了新的方向，对多种疾病的发病、进展机制进行了补充，给疾病的预防、治疗提供了新思路。目前研究认为mtDNA拷贝数变异与致病因素导致的氧化损伤高度相关，反映了细胞及mtDNA损伤程度。MtDNA受到轻度氧化损伤将导致拷贝数代偿性增加，过度的氧化损伤则发生拷贝数减少，核基因TP53和其他基因参与到mtDNA的修复和拷贝数的调控中。目前mtDNA拷贝数变异机制仍有尚未明确之处，例如不同组织拷贝数变异情况不同，不同种类恶性肿瘤拷贝数变异情况更是差异巨大，这种差异可能与组织器官自身能耗需求有关，但没有确切的结论，仍需继续研究。目前多项研究已经发现mtDNA拷贝数与多种疾病发病风险及预后之间具有相关性，有望成为疾病预防的新靶点及预测预后的新指标，同时鉴于mtDNA拷贝数测量简便，具有良好的应用前景，可为患者带来福音。