刘 华，付培芬，李 岩，温 凯，贾 莹，刘晓玫，张海丽，商云鹏，高明春，马 波，张文龙，王君伟

(东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030)

牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease，BVD/MD)是由 BVD病毒(BVDV)引起的一种呈多临床类型的疾病，主要表现为感染牛粘膜糜烂溃疡、腹泻、免疫抑制，怀孕母牛流产、产死胎、畸形胎以及持续感染等[1-2]。BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员，为单股正链RNA，全长约为12 300～12 500个核苷酸(nt)，由5'非编码区(5'UTR)、一个大的开放性阅读框(ORF)和3'UTR组成[3]。BVDV存在两个生物型：致细胞病变(CP)型和非致细胞病变(NCP)型。根据5'UTR序列不同分为两个基因型，Ⅰ型和Ⅱ型。BVDV各种基因型和生物型与其致病性之间没有必然的联系[4]。

本研究采用重叠RT-PCR的方法对实验室已分离的BVDV基因Ⅱ型HLJ-10分离株进行全基因组分段克隆及测序，并与GenBank中登录的BVDV全基因组序列进行同源性比较和遗传进化分析，初步阐明了该分离株的基本分子生物学特点以及在系统发生树中所处的位置。为构建BVDV的感染性克隆、探讨其基因功能及致病机理等奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株与细胞 BVDV基因Ⅱ型HLJ-10分离株为本实验室2010年分离自某国产商品化血清；Escherichia coliTG1为本实验室制备并保存；牛肾传代细胞(MDBK)为本实验保存。

1.2 主要试剂 病毒总RNA提取试剂盒EZNA?Viral RNA Kit购自OMEGA公司；鼠源反转录酶M-MLV购自Promega公司；高保真DNA聚合酶、pEASY-Blunt Simple载体购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自百泰克生物技术有限公司。

1.3 参考病毒株基因序列及登录号 NADL(AJ133738/USA)、Oloss(M96687/Germany) 、Oregon(AF091605/USA)、 Singer(DQ088995/Argetina)、 SD-1(M96751/SD-1)、 VEDEVAC (AJ585412/Hungany)、CP7(U63479/USA)、XJ-04(FJ527854/China)、NewYork'93(AF502399/USA)、SH-28 (HQ258810/China)、 890(U18059/Canada)、 JZ05(GQ888686/China)、 Hokutai(AB567658/Japan)、p11Q(AY149215/Canada)、KZ91CP(AB359933/Japan)和 p24515(AY149216/Canada)。

1.4 引物的设计与PCR扩增 参考GenBank中登录的序列，采用Primer5.0、DNAMAN等生物学软件设计覆盖全基因组的14对引物(如读者需要作者可以提供)，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。……