李建侠，刁有祥*，孟凡生，刘 霞，程彦丽，孙 静，吴海洋

(1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.临沂大学生命科学院，山东临沂276005)

鸭新城疫病毒病亦称鸭新城疫，是由鸭源新城疫病毒(NDV)引起的一种急性、败血性传染病，该病可造成鸭的大量死亡，对养鸭业危害严重[1-2]。传统观点认为NDV能够通过消化道、呼吸道、眼结膜等途径发生水平传播。本实验室从出壳后1日龄表现神经症状的雏鸭脑组织中分离到NDV[3]，我们推测该病毒可能是NDV感染种鸭后，侵入种鸭生殖系统，随精液或者在蛋白分泌进入种蛋，而导致出壳后的鸭发病。为此，我们应用分离到的NDV SDFCH株接种28周龄无NDV感染的樱桃谷肉种鸭，检测该病毒在种鸭生殖系统的分布情况。

1 材料和方法

1.1 病毒株、主要试剂及实验动物 鸭源NDV SDFCH株由本实验室分离、鉴定和保存[3]；禽流感病毒(AIV)H5、H7、H9亚型标准阳性血清、NDV标准阳性血清、EDS-76血清购自哈尔滨兽医研究所；抗NDV F蛋白单克隆抗体(MAb)由扬州大学秦爱建教授惠赠；APES粘片剂购自武汉博士德生物工程公司；DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；转录酶M-MLV、 RNA Inhibitor、 rTaqDNA Polymerase、pMD18-T、SalⅠ、EcoRⅠ均购自 TaKaRa公司；FITC-羊抗小鼠IgG(FITC-IgG)购自美国圣克鲁斯生物技术公司；实验用樱桃谷种鸭购自山东省莱芜市某种鸭场。

1.2 人工感染试验 将42只血凝抑制试验(HI)、病毒分离和RT-PCR检测为阴性的28周龄左右的樱桃谷肉种鸭随机分成A、B、C 3组，A组母鸭14只，接种NDV SDFCH株；B组公鸭14只，接种NDV SDFCH株，C组种鸭公、母各半，共计14只，为正常对照组，隔离饲养。根据预试验结果强毒最佳剂量为30×EID50。3组种鸭均饲养于密闭、洁净的环境中。

1.3 病料的采集 强毒接种4 d后，每隔2 d每组各迫杀2只，采集母鸭卵巢组织、不同发育阶段的卵泡、输卵管，公鸭采集睾丸、输精管，-20℃保存备用。部分输卵管病料用Bouin液固定，4℃保存备用。

1.4 病毒的分离与鉴定 将采集的病料剪碎、研磨，以pH7.4的PBS按1∶4匀浆，反复冻融3次，离心，取上清加抗菌素，置4℃过夜，菌检阴性后经尿囊腔接种9日龄～11日龄SPF鸡胚(0.1 mL/胚)，37℃孵育，进行常规病毒分离。

用鸡胚尿囊液进行血液凝剂(HA)试验，有血凝效价者用AIV H7亚型、H5亚型、H9亚型和NDV及EDS-76阳性血清进行HI试验。

1.5 NDV F基因的RT-PCR检测 按照参考文献[3]和[4]的方法进行F基因的扩增。

1.6 间接免疫荧光检测(IFA)对输卵管内NDV抗原定位 常规石蜡切片，并按照参考文献[5]的步骤和已优化的抗原修复条件等，一抗(抗NDV F MAb)1∶50～1∶100 稀释，羊抗小鼠 FITC-IgG 二抗按 1∶200～1∶400稀释，进行IFA染色，50%缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。

判断标准：无可见荧光为“-”；组织中细胞零星分布且少于5%，可见微弱荧光为“+”；组织中黄绿色细胞分布比例为5%～50%，可见有明亮的荧光为“++”；组织中黄绿色细胞分布比例大于50%，可见耀眼的荧光为“+++”。

2 结 果

2.1 人工感染试验

2.1.1 病毒的分离与鉴定 病料接种9日龄～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每一代均收获尿囊液进行HA和HI试验。结果显示：A、B、C各组所采集的卵巢组织、不同发育阶段的卵泡、输卵管、输精管等，病毒盲传至第2代开始有血凝价出现；公鸭睾丸自第3代开始有血凝价出现，血凝效价在21～23。继续增殖至4代～6代时，各分离株尿囊液均能凝集1%鸡的红细胞，血凝效价维持并稳定在26～27。各分离株均可以被NDV标准阳性血清所抑制，而不被AIV H5、H7、H9亚型和EDS-76阳性血清抑制，初步鉴定分离株为NDV。C组空白对照的种鸭未分离到NDV、流感病毒、鸭瘟病毒等。不同组织NDV分离情况见表1。

2.1.2 F基因扩增与同源性比较 NDV HI效价大于22的，均能扩增出 NDV F基因(图 1)。利用DNAStar Lasergene软件进行核苷酸同源性分析，与SDFCH株同源性在97.7%～100%，氨基酸同源性98.8%～100%。

2.2 IFA检测结果 A组种鸭利用IFA检测到输卵管纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞内有阳性信号存在(表2)。输卵管蛋白分泌部及子宫部IFA结果如图2、图3所示。

表1 不同组织NDV SPF鸡胚分离情况Table 1 NDV isolation using SPF chick embryos

表2 荧光信号结果统计Table 2 Statistics of fluorescence signal intensity

3 讨 论

有关NDV的传播方式，一般认为是通过被病毒污染的饲料、饮水、粪便或气溶胶经消化道、呼吸道或眼结膜以水平传播的方式传给易感禽。目前该病的水平传播途径已经很清楚，但NDV能否经种蛋垂直传播尚无确切定论。早在20世纪60年代，就有关于鸡NDV经输卵管传播的相关报道[5-6]。90年代初，Pospisil等从来源于免疫过的产蛋鸡群的雏鸡和鸡胚中检测到缓发型NDV，推测NDV有可能经种蛋传播[7]。Capua等也从鸡胚中分离到强毒株，并从产蛋鸡的泄殖腔棉试子及其仔代分离到NDV强毒[8]。孙淑红等也从来自有产蛋下降表现的一个肉用型父母代种鸡群的鸡胚中分离到NDV强毒[9]。

本研究中应用RT-PCR方法从NDV人工感染种鸭卵巢、各级卵泡以及输卵管中检测到NDV，同时应用IFA方法检测输卵管内NDV，结果发现病毒存在于输卵管蛋白分泌部和子宫部纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞内[10]。因此，我们推测NDV感染母鸭后，侵入卵巢、输卵管，病毒可能随卵黄形成、蛋白分泌进入种蛋。该结果与Chen等报道一致[11]。采集的输卵管组织病料中多数能分离到NDV，但有的未能分离到，可能由于病毒需要一定的时间定植到组织细胞中，并且存在个体差异[12]。公鸭人工感染NDV后，亦能在睾丸、输精管等生殖系统组织中分离到NDV，表明鸭源NDV也可以侵入公鸭生殖系统，可能随精液的排泄进入种卵。正常对照组未分离到任何病毒，IFA检测结果也为阴性。

综上所述，鸭源NDV能存在于母鸭输卵管粘膜上皮细胞及公鸭精液中，并随蛋白分泌、卵黄的形成、精液的排泄而进入种蛋中，发生垂直感染，可能是造成鸭胚死亡及1日龄雏鸭爆发新城疫的重要原因，关于该病垂直传播方式的机制还有待于进一步研究。

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