卞学兵，曾嘉梅，颜 焰，廖 敏，周继勇

(浙江大学农业部动物病毒学重点实验室，浙江杭州310058)

自1994年陈伯伦等在我国广东某鸡场首次分离到 H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)后，H9N2亚型AIV在我国的流行呈上升趋势，成为制约养禽业健康生产的重要病源[1-2]。由于在鸡群中流行的流感病毒的变异率大大高于水生鸟类，因此鸡是流感病毒的特殊宿主[3]。同时它也可以作为病毒的混合器和禽源、人源重组流感病毒的传播源，在流感病毒的进化中具有重要的作用[4]。本研究从疫苗免疫的发病蛋鸡体内分离一株H9N2亚型AIV，并对其进行遗传进化分析和致病性研究。

1 材料和方法

1.1 病料来源与病毒分离 采集浙江省建德市某鸡场出现产蛋下降和停止的送检发病鸡气管拭子和泄殖腔拭子。将拭子样品直接加入1 mL含有100 U/mL双抗的灭菌PBS中。4℃作用1 h，-70℃冻融一次后 12 000 r/min离心 10 min，取上清液以 0.22 μm滤膜过滤。处理后的上清即为病料研磨液，按0.2 mL/胚的剂量通过鸡胚尿囊腔接种10胚龄SPF鸡胚，37℃培养，收获死亡鸡胚的尿囊液。

1.2 SPF鸡胚、SPF鸡、血清、载体及感受态细胞 SPF蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸡购自杭州荐量兽用生物制品有限公司，隔离器内饲养；H1～H13标准阳性鸡血清由中国农业大学刘金华教授惠赠；pMD18-T载体购自TaKaRa公司；Top10感受态细胞为本实验室保存。

1.3 血球凝集试验与血球凝集抑制试验 参照中华人民共和国AIV检测技术标准(GB/T 18936-2003)中血球凝集试验与血球凝集抑制试验的步骤进行。

1.4 分离物的鸡胚半数致死量(EID50)测定 按照文献[5]方法，将病毒尿囊液10倍倍比稀释(10-6～10-10)，每稀释度病毒液接种6枚9日龄~11日龄SPF鸡胚0.1 mL/胚，定时观察并记录每枚鸡胚的死亡时间。……