朱其顺,李其琴,颜守保

(淮南师范学院 生物工程学院,安徽 淮南 232038)

板栗含有大量淀粉及蛋白质、脂肪、钙、磷、铁及多种维生素和微量元素,素有“千果之王”的美称,同时亦是一种物美价廉、富有营养的滋补品。中医认为,板栗有养胃健脾,补肾强筋,活血、止血之功能,并有益于高血压、冠心病的防治。我国板栗种植面积较广,占世界种植面积的80%,年产量超过100×104t,居世界首位,但板栗贮藏性能差,易损耗。据调查,我国每年因贮藏不当造成的板栗损耗率在30%以上,这严重地影响了板栗的经济效益。对于板栗的加工利用,目前国内已有相关的研究成果,如:利用板栗加工面包[1]、酿制板栗果酒[2]、制作板栗饮料[3-4]等。而以板栗为主要原料酿制蒸馏酒,国内尚未有相关文献研究。

板栗是皖西大别山区盛产的重要坚果,年产量约25～28万t[5],淀粉含量较高,适于做酿酒的原料。本研究以浓香型白酒大曲中分离筛选获得优良酵母菌为酿造菌种,通过秸秆纤维素固定化酵母细胞、原料配比和发酵工艺优化等手段开发板栗蒸馏酒,并进行质量评价,为进一步应用推广提供参考依据。

一、材料和方法

(一)供试材料

板栗,一等品,产地安徽金寨;大麦芽,优级,产地澳大利亚;玉米,优级,产地安徽淮南;糯米,优质,产地安徽凤台;α-淀粉酶(3 000 U/m L;p H值,4.0～5.5;温度:50～60 ℃);糖化酶(100 000 U/m L;p H 值,4.0～4.5;温度,58～60 ℃);纤维素酶(20 000 U/m L;p H 值,4.8～5.2;温度,55～60 ℃)。

斜面培养基配制:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母浸膏5 g,琼脂粉15～20 g,溶化后加蒸馏水定容至1 L,121 ℃灭菌25 min。

YEPD 培养基配制:蛋白胨10 g,葡萄糖50 g,酵母浸膏10 g,琼脂15～20 g,蒸馏水1 000 m L,自然p H,用于酵母的分离、培养和增殖。

(二)发酵菌种的获得

1.菌株筛选

取1 g白酒大曲加入99 m L 的无菌水,制成10-2g/m L的大曲悬液置于三角瓶中。梯度稀释后,取稀释菌液1μL,涂布于YEPD 培养基上,在30 ℃下,培养48 h后,对培养皿长出的不同菌落特征和不同闻香气味的酵母菌做标记,再经多次平板划线,获得纯菌株,4 ℃条件下保藏。

2.菌株发酵能力分析

将200 m L麦芽汁(浓度为250 g/L)加入250 m L三角瓶中,灭菌后,在无菌条件下分别加入10%纯种酵母菌种子液(调整浓度为1×107个/m L),30 ℃下静置培养7 d,发酵结束后检测酒精度和残糖量。

3.发酵产物中可挥发性风味物质评价

称取一定量的板栗仁,洗净后置于蒸笼蒸30 min,按照1∶2.5的比例加入水,经粉碎打浆后,转入蓝口玻璃瓶中,按照20 U/g板栗的用量加入α-淀粉酶,并在95 ℃水浴中液化0.5～1 h;液化结束后,将混合物降温至60 ℃以下并调整p H至4.5,然后按照100 U/g板栗的添加量加入糖化酶,60 ℃条件下保温10～12 h。经过固液分离得到的糖液分装入250 m L三角瓶中,113℃条件下灭菌10 min。各组灭菌冷却后,分别按照10%接种量接入酵母种子液,30℃条件下发酵7 d后,再分别取100 m L 发酵液放入蒸馏瓶中,同时加入100 m L 水,加热蒸馏出100 m L 冷凝液通过GC-MS分析其中可挥发性风味物质。

4.酵母发酵产物风味感官评价

将上述1.2.3中板栗发酵液经壶式二次蒸馏后获得的酒液进行风味感官评价,评定样品的感官特性和整体特征。

(三)玉米秸秆固定化酵母细胞

1.玉米秸秆的纤维酶修饰

干玉米秸秆纤维组织呈多孔状,是酵母细胞固定化的良好载体,能提高乙醇生产率。具有环境友好、强度高、分批发酵、无毒、通透性好,适于细胞生长繁殖的优点。研究利用纤维素酶对玉米秸秆表面进行适当修饰,增大纤维比表面积,解决了酵母细胞吸附于载体的表面而易脱落、稳定性较差的缺点。

干玉米秸秆取自安徽省淮南市郊区,剥除外皮后,然后剪成小块(约2 cm×2 cm),用水清洗后,放入(50±0.5)℃烘箱中备用。将60 g预处理后的玉米秸秆小块、240 g的醋酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L)和纤维素酶(5 000 U)分别转入1 000 m L烧杯中,在55 ℃、p H5.0条件下分别酶解0、2、4和6 h。酶解反应结束后,将玉米秸秆小块用水清洗至洗液p H 为中性,再放入(50±0.5)℃烘箱烘至恒重,备用。

2.优质酵母菌增殖培养

取数环分离筛选获得优质菌株斜面种子接入装有100 m L增殖培养基的250 m L三角瓶中,30℃、摇床转速200 r/min条件下培养24 h,制得酵母细胞悬浮液,备用。

3.酵母细胞的固定化

酵母细胞经过增殖培养后在4 000 r/min、4℃下离心10 min,收集酵母细胞,配制成浓缩液,并控制酵母细胞浓度为1.0×108～10.0×108个/m L。将30 g经修饰处理后的干玉米秸秆浸入100 m L 酵母细胞浓缩液(4.6×108个/m L)中,在(30±0.5)℃、160 r/min摇床下振荡混合24 h 后,转入100 m L 增殖培养基中(30±0.5)℃、160 r/min摇床下培养24 h。培养结束后,在无菌条件下转入三角瓶或固定化细胞反应器中用作乙醇发酵。

(四)酿造工艺

图1 板栗蒸馏酒酿造工艺流程图

板栗蒸馏酒酿造主要工艺流程如下。

(1)配料和预处理:将板栗、大麦、玉米和糯米按照一定比例配料,其中板栗、玉米和糯米洗净后分别浸入1.5倍体积水中浸泡约1 h;

(2)蒸煮:将浸泡好的板栗、玉米和糯米捞出,分别置于蒸笼蒸30 min;

(3)打浆:蒸煮后的板栗和玉米移入组织匀浆机中,加入适量水进行粉碎打浆;

(4)液化:将板栗、玉米浆液与蒸熟后的糯米(不需打浆)转入蓝口玻璃瓶中,按照20 U/g混合原料的用量加入α-淀粉酶,95 ℃水浴液化0.5～1 h;

(5)糖化:将上述液化混合物料降温至60 ℃以下并调整p H 至4.5,添加粉碎后的大麦芽,60℃保温10～12 h;

(6)固液分离:糖化后混合物料经过滤后获得糖化醪液,调节p H 至5.0;

(7)接种:向上述糖化醪液中接入一定量的固定化酵母细胞,混匀后30℃条件下静置发酵7 d;

(8)固液分离:将发酵成熟醪液再次过滤,过滤后剩余固定化酵母细胞用无菌水洗涤后用于下一批次发酵;

(9)蒸馏:将过滤后的发酵液进行蒸馏。采用二次蒸馏法,第一次蒸馏将其中挥发性成分蒸出,酒精度大约为20%vol～25%vol;将一次蒸馏酒液继续二次蒸馏,获得酒精度约为60%vol原酒;

(10)储藏、调配:将流程(9)中所获得原酒放入新橡木桶中储藏6 个月后,移出降度调配成40%vol左右的成品酒。

(五)酿造原料配比优化

试验基于1.4中板栗蒸馏酒酿造方法,将板栗、大麦芽、糯米、玉米按照不同比例配料,各试验处理总固体重量为300 g,液化时固液比为1∶2.5。对获得板栗蒸馏酒原酒进行感官评价,确定最佳原料配比。

(六)酿造工艺参数优化

1.固定化细胞不同接种量对板栗蒸馏酒酿造的影响

基于1.5中的最佳试验条件,将糖化醪液中分别接入2%、4%、6%和8%(m/v)的固定化酵母细胞,按照1.4中方法获得板栗蒸馏酒原酒,并进行感官评价。

2.不同温度对板栗蒸馏酒酿造的影响

基于1.6.1中的最佳试验条件,将1.4(7)中糖化醪液接入固定化酵母细胞,分别置于20、25、30、32和34 ℃条件下,静置发酵7 d,对成熟发酵醪液测定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸馏获得板栗蒸馏酒原酒,并进行感官评价。

3.不同起始p H 对板栗蒸馏酒酿造的影响

基于1.6.2中的最佳试验条件,将1.4(6)中糖化醪液p H 分别调节至4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0;其它步骤同1.6.2。获得的成熟发酵醪液测定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸馏获得板栗蒸馏酒原酒,并用于感官评价。

4.不同发酵时间对板栗蒸馏酒酿造的影响

基于1.6.3中的最佳试验条件,将1.4(7)中糖化醪液分别接入最佳量固定化酵母细胞,置于最佳温度条件下,分别静置发酵5、6、7、8、9 和10 d;其他步骤同1.6.3。获得的成熟发酵醪液测定酒精度,按照1.4(9)中方法蒸馏获得板栗蒸馏酒原酒,并用于感官评价。

(七)确定糖化后滤渣清洗次数

糖化后过滤残渣中残留较多的糖分,为充分利用原料,基于1.6.4中的最佳试验条件,于上一批次1.4(6)中固液过滤后获得的残渣加入70 ℃热水(固液比为1∶1),70 ℃条件下搅拌混合30 min后,3 000 r/min离心10 min,获得滤液用于本批次板栗蒸馏酒酿造工艺水。按照相同方法分别洗涤0 次、1 次、2 次和3 次,其他步骤同1.6.4。清洗后的滤渣测定残留还原糖含量,获得的成熟发酵醪液测定酒精度。

(八)分析方法

酒精度测定采用蒸馏比重法[6](P653);还原糖含量的测定采用DNS 法(APHA,American Public Health Association);固定化载体中细胞生物量的测定采用重力法[7]。

1.可挥发性风味物质分析

(1)顶空固相微萃取(HS-SPME)条件。选取50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS 固相微萃取头,第一次使用需要在气相色谱进样口在230 ℃下老化5 min。

萃取条件:精确称取3.0 g样品放入顶空瓶中,盖上瓶盖,于60℃水浴超声波震荡仪中平衡15 min,然后于60 ℃水浴顶空萃取30 min,将萃取头取出插入GC-MS 进样口解吸4 min,进行GC-MS分析。

(2)气相色谱-质谱(GC-MS)分析条件。

气相色谱条件:DB-WAX 色谱柱(60 m×250μm×0.25μm);手动不分流进样,进样口温度230 ℃;程序升温:40 ℃保持1 min,5 ℃/min的升温速率到180 ℃,保持1 min,最后以8 ℃/min升温到230 ℃,保持7 min;载气:高纯度氦气,流速为1 m L/min。

质谱条件:EI电离源,电子能量70 e V,扫描质量范围20～550 u,离子源温度230 ℃,接口温度230 ℃。

GC-MS分析:用50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Agligent公司;自动SPME进样器,美国Agligent公司;15 m L 带硅橡胶垫的样品瓶,美国Agligent公司;Agligent 7890N-5975B气相色谱—质谱联用仪,美国Agligent公司。

(3)定性与定量分析。

定性:对质谱挥发性风味成分进行检测,并与标准库的物质(NIST)匹配,匹配度超过800的判定结果保存。

半定量:以2-辛醇为内标,先将各阶段样品中鉴定的挥发性化合物的峰面积与2-辛醇峰面积之比来初步判断,再进一步计算这些挥发性化合物的含量。

2.风味感官评价

本研究邀请A 省H 学院20位食品质量与安全专业的学生(男生和女生各10名)对酒样的香气、口感、风味、酸度的感官特性以及产品的整体特征进行评定。采用10分制的评价方法对试样进行感官评价。(对香气、口感、风味、酸度进行综合性评定,其中1～4分:综合体验感低;5～7分:及格;8～10分:综合体验感良好,口感佳。)

3.理化指标测定

依据食品安全国家标准GB 12456—2021分析方法测定总酸,依据食品安全国家标准GB/T 10345—2007分析方法测定总酯和可溶性固形物的含量,依据GB/T 5009.48分析方法检测甲醇和氰化物的含量。

二、结果与讨论

(一)优质酵母菌的筛选

通过分离筛选,获得11株菌落形态不同和闻香不同的酵母菌。以10%的接种量(调整细胞浓度为1×107个/m L),分别添加到麦芽汁(30 ℃、糖度250 g/L)中,发酵7 d,每天观察发酵情况(气泡的产生量和显微镜镜检),7 d后检测酒精度和残糖量,结果见表1。

表1 不同酵母菌发酵能力测试结果

从表1可以看出,各酵母菌发酵能力差异很大,其中编号为HN006 的酵母菌综合发酵能力最强,其酒精度高,残糖量低。

本研究分别以该11 株菌为发酵菌株,按照1.4中方法获得板栗蒸馏酒原酒,通过GC-MS分析其中可挥发性风味物质。研究结果(表2)表明,11种酵母菌发酵所获得的板栗蒸馏酒原酒中主要含有11 种可挥发性风味物质,包括醇类(4种)、酸类(3种)、酯类(3种)和硅氧烷化合物(1种)。醇类包括丙三醇、异戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇。其中异戊醇为酒中的杂醇油,含量较高时会使酒体辛辣苦涩,并导致“上头”;丙三醇和2,3-丁二醇有醇甜感;苯乙醇具有玫瑰香气的风味。因此,相对高含量的丙三醇、2,3-丁二醇、苯乙醇对香气和口感有促进作用。从表3中可以看出,酵母菌HN006所获得的板栗蒸馏酒原酒中含有较高的丙三醇、2,3-丁二醇、苯乙醇,而异戊醇含量相对较少。此外,较高含量的乙酸、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯对形成酒体风味具有积极作用。

表2 不同酵母菌种所获得的板栗蒸馏酒可挥发性风味成分(μg/10 m L)

表3 不同原料配比对板栗蒸馏酒酿造的影响

分别对其11种酵母菌获得的板栗蒸馏酒原酒进行感官风味评价,并用Origin 8软件绘制不同酵母菌种酿造原酒风味雷达图。结果(图2)显示,酵母菌株HN006 所产板栗蒸馏酒原酒评价得分为:口感8.6分,香气8.7分,风味8.4分,酸度8.3分,总体评价8.5分,均较优于其他菌株。综合上述分析,选择菌株HN006 为最佳酿造菌株。

图2 不同酵母菌种酿造原酒风味雷达图

(二)酿造原料配比优化

不同原料配比对板栗蒸馏酒酿造的影响见表3。由表3可见,板栗添加量一定条件下,随着大麦芽比例的增加,感官评价得分增大,相应发酵液中酒精含量也较高,主要是大麦芽有显著的麦香以及含有较多的糖分。其中板栗:大麦芽:糯米:玉米为6∶2∶1∶1时,获得蒸馏酒原酒的感官评价得分最高,为9.2,此时发酵液中酒精度较高,为7.7(v/v,%)。因此,最佳酿造原料配比为板栗∶大麦芽∶糯米∶玉米=6∶2∶1∶1。

(三)工艺参数优化

1.不同温度的影响

酵母菌的最适生长温度一般在20～30 ℃,超过35℃其生长将会受到抑制,种属之间存在较大的差异。本试验考察了不同发酵温度对板栗蒸馏酒酿造的影响,结果(图3)表明,发酵温度为25 ℃时获得了较高的乙醇含量,会生成更多的风味物质,整体感官评价最好,故选择25 ℃为最佳酿造温度。

2.不同初始p H 的影响

p H 对菌体的生长和产物的合成具有很大的影响。选择最适p H 的原则既有利于微生物菌体的生长繁殖,又能获得较高的产量。本实验考察了不同初始p H 对板栗蒸馏酒酿造的影响,结果如图4所示。

图4 不同pH 对板栗蒸馏酒酿造的影响

由图4 可知,在初始p H 为4～5.0 范围内[8](P45),发酵醪液中乙醇含量随p H 值的增加而增加;在p H 值为5.0时,乙醇浓度最大为8.2%(v/v);当p H 值＞5.0,乙醇含量随初始p H 值的增加而下降。因此,获得最佳的发酵初始p H 值为5.0。

3.不同发酵时间的影响

由图5可知,前期随着发酵时间的增加,乙醇含量不断增加,到第7 天时,达到最大值,为8.2% (v/v),第8天时,乙醇含量变化不明显,但整体感官评价最佳;随后,乙醇含量和整体感官评价逐渐下降。因此,选用8 d为最佳发酵时间。

图5 不同发酵时间对板栗蒸馏酒酿造的影响

(四)滤渣清洗次数的影响

由图6可知,随着糖化后滤渣清洗次数的增加,滤渣中还原糖含量不断降低,相应发酵醪液中乙醇含量不断增加,当清洗次数为2时,乙醇含量最高,因此确定糖化后滤渣清洗次数为2次,并将清洗滤液用于板栗蒸馏酒酿造。

图6 滤渣清洗次数对板栗蒸馏酒酿造的影响

(五)成品酒质量特性

将成熟发酵醪液通过壶式蒸馏“两次蒸馏”工艺获得板栗蒸馏酒原酒,经过新橡木桶储存6个月后,降度调配为40%vol蒸馏酒产品。感官评价结果表明:酒度数适中,产品呈浅黄色、外观澄清透明无沉淀;具有板栗、大麦芽、玉米和糯米的复合香气以及橡木桶储存而产生的橡木香气;香气浓郁、入口细腻、滋味醇厚、爽口,具有优级威士忌酒感官特征。

对板栗蒸馏酒降度调配产品主要理化指标进行测定,结果详见表4。

表4 板栗蒸馏酒主要理化指标

由表4可知,总酸和总酯含量达到《威士忌》(GBT 11857—2008)优级标准,甲醇和氰化物含量均符合食品安全国家标准《蒸馏酒及其配制酒》(GB 2757—2012)的规定。其中含有微量可溶性固形物,主要与储酒过程中酒液汲取橡木桶芳香物质成分有关系。

三、结 论

本研究从浓香型白酒大曲中分离筛选获得优良酵母菌株,然后以板栗、大麦、玉米、糯米为主要原料,在传统蒸馏酒酿造工艺基础上,通过秸秆纤维素固定化酵母细胞、酿造原料配比优化、发酵工艺优化和确定糖化后滤渣清洗次数等手段开发大别山板栗蒸馏酒,并获得最佳工艺参数:发酵温度为25℃,初始发酵p H 为5.0,发酵时间为8 d;通过壶式“两次蒸馏”工艺获得的优质板栗蒸馏酒原酒,经过橡木桶储藏、降度调配后获得成品酒。获得的板栗蒸馏酒成品酒,复合香气充足,口感佳;主要理化指标均达到食品安全国家标准优级水平。研究结果为板栗蒸馏酒酿造和应用推广提供了一定的基础依据。