龚舒蓓，范文来，徐岩

(江南大学 生物工程学院 教育部工业生物技术重点实验室，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)

白酒独特的生产工艺是决定白酒独特风味的重要因素[1]。传统白酒以手工生产为主，近年来生产方式逐步往机械化方向转变，基本实现了原辅料加工、入窖和出糟等环节机械化或自动化。目前，芝麻香型白酒生产机械化程度较高[2]。众所周知，机械化装置难以模拟人工操作，因此造成机械化白酒与手工工艺酒存在风味与质量差异[3-4]。

然而对传统法白酒和机械化白酒差异研究的报道甚少，主要是从酒体感官特征、出入池糟醅理化指标、出酒率和优级率等方面对比两种工艺生产的白酒[5-6]，鲜见对白酒中整体的挥发性及难挥发性物质的比较研究。鉴于此，本研究对芝麻香型手工原酒与机械化原酒的挥发性和难挥发性成分分别进行检测，并通过对两工艺原酒微量成分的定量比较，找到其中差别较大的化合物，为在传承传统白酒生产工艺的基础上提高白酒机械化水平提供指导性数据。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

样品：20个当天生产的芝麻香型原酒(优级手工原酒，4个样品，编号T1～T4；一级手工原酒，4个样品，编号T5～T8；优级机械原酒，6个样品，编号M1～M6；一级机械原酒，6个样品，编号M7～M12，酒精度64%～69%vol)，均由山东景芝酒厂提供。

试剂：NaCl和磷酸(分析纯)，上海国药集团；乙醇、NaH2PO4、苯基-β-D-葡萄糖苷、六甲基二硅胺(hexamethyldisitazane, HMDS)、己酸甲酯、乙酸正戊酯、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、吡啶、盐酸羟胺和表 1中鉴定出的94种化合物标准品(色谱纯)，Sigma-Aldrich公司；超纯水(Milli-Q)，均为煮沸并冷却至室温的超纯水。

1.2 仪器与设备

气相色谱质谱联用仪(GC 6890N-MSD 5975)，Agilent 公司； 气相色谱仪(GC 6890N)，Agilent 公司； 三重四级杆气质联用仪(GC Trace1310-MS TSQ8000)，Thermo Scientific；氮吹仪，Organomation公司；旋转蒸发仪，Buchi 公司；超高效液相色谱仪，Waters UPLC H-Class。

1.3 实验方法

1.3.1 难挥发化合物HMDS衍生化定量

取10 mL稀释至酒精度60%vol酒样于100 mL旋蒸瓶中，加入6 μL质量浓度为256 mg/L的内标苯基-β-D-葡萄糖苷，40 ℃真空旋转蒸发至500 μL，然后将其转移到2 mL样品瓶中，缓慢氮吹至干，再参照文献[7]改进后方法处理，先往吹干样品中加入70 μL吡啶(含质量浓度为25 g/L的盐酸羟胺)，摇匀，75 ℃反应30 min，再依次加入70 μL HMDS和7 μL TFA，摇匀，45 ℃反应30 min，最后12 000 r/min离心3 min，取1 μL进行GC-MS分析。

GC条件：载气为高纯氦气，流速1 mL/min，5∶1分流进样模式；色谱柱：TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口和检测器温度均为250 ℃。升温程序：65 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至280 ℃保持8 min。MS条件：电子电离源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度300 ℃，SCAN模式扫描范围：50～650 amu。

标准曲线：以60%vol酒精水溶液配制一定浓度梯度待测物标准液，按照酒样处理方法进行GC-MS分析。采用选择离子法(SIM)计算各化合物的峰面积，以待测物与内标峰面积之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，分别绘制标准曲线。

1.3.2 超高效液相色谱(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)定量乳酸方法

参考文献[8]方法，用超纯水将白酒样品稀释至10%vol左右，取1 mL过0.22 μm有机针头式滤器。

UPLC色谱条件：T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)，流动相：100% NaH2PO4(质量浓度3.12 g/L，pH 2.7)，检测波长210 nm，柱温40 ℃，流动相流速0.25 mL/min，进样量1 μL。

标准曲线：以10%vol酒精水溶液配制一定浓度梯度乳酸标准液，各梯度液处理方法与样品一致。以乳酸峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)结合GC-MS定量易挥发化合物

参照文献[9] 修改方法，准确吸取18 mL稀释至10%vol酒样于样品瓶中，加6 g NaCl饱和，添加内标己酸甲酯(终浓度1.02 mg/L)，摇匀后加入1 mL重蒸乙醚，振荡萃取3 min，待静置分层后，吸取上层有机相500 μL转移至2 mL样品瓶中，氮吹浓缩至250 μL，取1 μL进行GC-MS分析。

GC条件：载气为高纯氦气，流速2 mL/min，不分流进样模式；色谱柱：DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口和检测器温度均为250 ℃。升温程序：50 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至230 ℃保持15 min。MS条件：电子电离源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，SCAN模式扫描范围：35～350 amu。

标准曲线：以10%vol酒精水溶液配制一定浓度梯度的待测物标准液，按照酒样处理方法进行GC-MS分析。采用选择离子法(SIM)计算各化合物峰面积，以待测物与内标峰面积之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，分别绘制标准曲线。

1.3.4 气相色谱-火焰离子检测器(gas chromatography flame ionization detector，GC-FID)法定量高含量挥发性化合物

参考国标GB/T 10345—2007法[10]，用超纯水将酒样稀释至60%vol，加入内标乙酸正戊酯(终质量浓度176 mg/L)，取1 μL通过DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱进行分离、测定。

2 结果与讨论

2.1 手工原酒与机械原酒中的化合物

通过GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法在芝麻香型手工原酒和机械化原酒中一共定量94种化合物，包括酸类27种、醇类8种、酯类24种、芳香族15种、酚类3种、呋喃类6种、糖醇类5种、糖类4种、缩醛类1种以及内酯类1种。手工原酒的化合物总量比机械化原酒高，分别为9.64～10.2 g/L和8.62～9.05 g/L。其中，一级手工原酒化合物总量比一级机械原酒高18.0%，而优级手工原酒化合物总量比优级机械原酒高6.5%。

2.2 手工原酒与机械原酒中的酯类化合物及其差异比较

酯类是芝麻香型原酒中含量最丰富的，其质量浓度合计为6.29～7.68 g/L，分别占手工原酒和机械原酒物质总量的75.5%～75.7%和73.0%～74.5%(表1)。检测到的24种酯类物质以乙酯类化合物居多，它们主要是由脂肪酸和乙醇酯化形成[11]。其中，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量较高，分别达到2.96～4.14 g/L和2.84～3.48 g/L，与文献报道的结果类似[9]，两者含量占到酯类总含量的71.2%～72.0%；其次是丁酸乙酯和己酸乙酯含量，范围分别为79.2～113 mg/L和29.9～86.6 mg/L。首次在芝麻香型白酒中定量到4-酮基戊酸乙酯，含量为395～586 μg/L，它曾在白兰地香气研究[12]中检测到。另外，由于酒样批次差异、生产不稳定的原因，导致个别酯类化合物如庚酸乙酯的含量偏差过大，下述的原酒中某些醇类、酸类、芳香族化合物等也有类似情况。

相比手工原酒，机械化的优级及一级原酒中酯类总量下降，分别下降7.6%(优级)和18.1%(一级)。就芝麻香型优级原酒而言，与手工原酒相比，4-酮基戊酸乙酯是机械原酒中上升最明显的酯类，上升46.7%；己酸乙酯、丁酸异戊酯和乳酸丁酯在机械原酒中下降明显，分别下降55.0%、43.6%和39.8%。就芝麻香型一级原酒而言，与手工原酒相比，庚酸乙酯是机械原酒中上升最明显的酯类，上升123.0%；丁酸异戊酯和乳酸丁酯在机械原酒中下降明显，分别下降38.3%和59.9%。另外，比较不同工艺原酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯及乳酸乙酯这4种含量较高的酯发现，除了优级机械原酒中乙酸乙酯的含量相比优级手工原酒上升15.7%外，其他3种酯的含量在机械原酒中均下降。

表1 芝麻香型手工原酒与机械原酒中酯类物质的平均含量Table 1 Average contents of the esters in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

注：a：V代表挥发性化合物并按出峰顺序编号；b：N代表难挥发性化合物并按出峰顺序编号；c：含量单位mg/L；d：采用GC-FID定量；e：带TMS基团衍生物保留时间，采用衍生化方法定量；f：平均浓度±标准偏差；g：该类物质占酒样总含量的百分比；h：计算公式为(机械原酒物质A的含量-手工原酒物质A的含量)/手工原酒物质A的含量×100%。下同。

2.3 手工原酒与机械原酒中的醇类化合物及其差异比较

醇类是芝麻香型原酒中含量第二高的，在手工原酒和机械原酒中的含量分别为1.34～1.42 g/L和1.20～1.26 g/L，占化合物总量的13.2%～14.7%(表2)。手工原酒和机械原酒中均检测到挥发性醇类7种和难挥发醇类1种，它们一般来源于糖和氨基酸的降解[13]。其中，异戊醇含量最高，达到731～885 mg/L，异丁醇次之，达到226～259 mg/L。A/B值是指异戊醇与异丁醇的比值，两工艺原酒的A/B值均为3.4，与文献报道一致[9]。仅在原酒中检测到丙三醇(即甘油)，这是一种难挥发醇类物质，它可能是酵母菌酒精发酵的副产物[14]，含量为328～372 μg/L。

相比手工原酒，机械化的优级及一级原酒中醇类总量下降，分别下降10.5%(优级)和10.7%(一级)。另外，从单个化合物来看，机械化的优级酒及一级酒中正丙醇都上升，此外机械一级原酒的正戊醇也有所上升，其余醇类在机械化的优级及一级原酒中下降，其中下降最多的是正丁醇，分别下降36.4%(优级)及52.8%(一级)。醇类是白酒中重要的骨架成分，机械化白酒中醇类含量普遍降低，这可能是导致手工酒与机械化酒存在风味差异的一大原因。

表2 芝麻香型手工原酒与机械原酒中醇类物质的平均含量Table 2 Average contents of the alcohols in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

2.4 手工原酒与机械原酒中的酸类化合物及其差异比较

两工艺原酒中酸类物质的含量居第3且种类最多，包括了8种羟基酸、1种酮酸、1种二元酸、17种直链脂肪酸共27种，含量合计达到868～997 mg/L，占化合物总量的9.0%(手工原酒)～11.0%(机械原酒)，见表 3。其中，乙酸是含量最高的直链脂肪酸(705～849 mg/L)，乳酸是含量最丰富的羟基酸(73.6～96.6 mg/L)，两者含量占到酸类总含量的92.3%～94.0%。直链脂肪酸中除棕榈油酸、十二烷酸、十四烷酸和十八烷酸外含量均在1 mg/L以上，其中大部分短链脂肪酸由发酵过程中的细菌产生[13]；丁二酸(又叫琥珀酸)和丙酮酸是三羧酸循环中重要的有机酸，它们在酒中的含量低，其平均含量分别为40.7 μg/L和157 μg/L；原酒中的羟基酸除乳酸外，含量较低，一般在3～300 μg/L之间。

表3 芝麻香型手工原酒与机械原酒中酸类物质的平均含量Table 3 Average contents of the acids in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

续表3

编号化合物RI手工原酒含量f/ (μg·L-1)机械原酒含量f/(μg·L-1)机械原酒相比手工原酒增减/%h优级一级优级一级优级一级N32油酸2 224e6 130±56.36 200±87.75 970±1765 810±172-2.7-6.3酸类 小计c868(9.0%)g934(9.2%)997(11.0%)944(11.0%)14.91.1

注：i：采用UPLC定量。

相比手工原酒，机械化的优级及一级原酒中酸类总量上升，分别上升14.9%(优级)和1.1%(一级)。就芝麻香型优级原酒而言，与手工原酒相比，机械原酒含量明显上升的酸是2-羟基丁酸，上升128.4%， 而含量明显下降的酸有异丁酸、3-羟基丙酸和3-羟基丁酸，分别下降36.7%、33.7%和36.3%。就芝麻香型一级原酒而言，与手工原酒相比，机械原酒中含量明显上升的酸有2-羟基丁酸和己酸，分别上升153.9%和122.4%， 而含量明显下降的酸有3-羟基丙酸和3-羟基丁酸，分别下降43.1%和55.4%。

2.5 手工原酒与机械原酒中的呋喃类和芳香族化合物及其差异比较

手工原酒和机械原酒里检测到的6种呋喃类化合物总量都在70 mg/L以上(表4)。其中，糠醛是最主要的呋喃类化合物(≥28.1 mg/L)，主要产生于蒸馏过程[11]。

表4 芝麻香型手工原酒与机械原酒中呋喃类和芳香族化合物的平均含量Table 4 Average contents of the furans, and aromatic compounds in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

相比手工原酒，机械化的优级及一级原酒中呋喃类总量下降，分别下降21.2%(优级)和25.2%(一级)。与手工原酒相比，机械化的优级和一级原酒中糠醛含量均下降，下降43%左右；优级和一级机械原酒中2-糠醇、丁酸-2-糠酯、2-糠酸乙酯、乙酸-2-糠酯和2-糠酸的含量均上升，其中含量上升最多的是2-糠醇，分别上升95.3%(优级)及64.4%(一级)。

9种易挥发和6种难挥发芳香族化合物在两工艺原酒中被检测到，含量合计为31.2～33.8 mg/L(表 4)。其中，以2-苯乙醇含量最高，达到19.4～21.9 mg/L。芝麻香型白酒中首次定量到4-羟基苯甲酸和4-羟基苯乙醇，它们可能是在制麦曲过程中由微生物生成[13]。

手工原酒与机械化原酒中芳香族类总量相差不大，但个别化合物含量存在较大差别。就芝麻香型优级原酒而言，与手工原酒相比，机械原酒中3-苯丙酸含量上升最多，达31.5%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降明显，下降42.3%。就芝麻香型一级原酒而言，与手工原酒相比，机械原酒中含量上升明显的芳香族物质有3-苯丙酸和4-羟基苯乙醇，它们分别上升73.0%和90.2%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降最多，达38.0%。

2.6 手工原酒与机械原酒中的其他类化合物及其差异比较

两工艺原酒中的其他类化合物总量为1.28～1.65 mg/L，在机械原酒中的含量按酚类、缩醛类、糖醇类、内酯类和糖类物质依次降低(表5)。其中，3种酚类物质可能来自于发酵过程中木质素的降解[15]；1,1,3-三乙氧基丙烷是唯一定量的缩醛类物质，它是在低pH值下由丙烯醛和乙醇缩合产生[16]；还在酒中定量到的γ-壬内酯、4种糖以及5种糖醇类，但含量较低，合计只有几百μg/L。

表5 芝麻香型手工原酒与机械原酒中酚类、缩醛类、内酯类、糖醇及糖类化合物的平均含量Table 5 Average contents of the phenols, acetal, lactone, sugar alcohols, and sugars in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

从各类物质总量来看，两工艺原酒中酚类总量差别最大，与手工原酒相比，机械化的优级及一级原酒中酚类总量分别上升174.2%(优级)和373.1%(一级)。从单个化合物来看，相比优级手工原酒，优级机械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚含量上升明显，分别上升339.0%和163.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降最多，下降了57.3%。同样地，一级机械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚含量相比一级手工原酒上升明显，分别上升537.5%和408.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降67.1%。

虽然手工原酒与机械原酒中检测到的化合物种类一致，但两个工艺原酒中部分化合物含量存在明显差别，这可能是由于白酒手工工艺与机械化酿造过程给酿酒微生物提供的环境存在差别，进而影响它们的生长代谢造成，但差异主要是在哪个工艺阶段产生的，还有待进一步研究。

3 结论

本研究采用GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法，在芝麻香型手工原酒与机械原酒中均检测到94种化合物。无论酒样等级，手工原酒的化合物总量高于机械原酒；传统手工酿造原酒中酯类、醇类、呋喃类、缩醛类、糖和糖醇物质含量相对较高，而机械化酿造原酒中酸类、酚类和内酯类物质含量相对较高。对比两个工艺酒的微量成分，发现白酒经过机械化酿造后，4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚、2-羟基丁酸和2-糠醇的含量明显上升，1,1,3-三乙氧基丙烷、乳酸丁酯、3-羟基丁酸、正丁醇、糠醛、丁酸异戊酯、丁酸-2-苯乙酯和3-羟基丙酸的含量明显下降。接下来研究将从白酒手工与机械化酿造工艺过程(如原料、制曲、发酵、蒸馏等)跟踪分析这些差异物质的含量，确定产生差异的原因或某个关键环节。