马世源，周 健，明红梅，何朝玖，任 清，熊堂语，马 浩，胥 佳

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643002；2.宜宾南溪酒业有限公司，四川宜宾 644100；3.北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048）

浓香型白酒是我国白酒中的典型代表之一，具有窖香浓郁、绵柔甘洌、入口绵甜、香味协调及尾净余长等风格特点。与其他香型白酒酿造相比，浓香型白酒酿造具有“泥窖固态发酵，采用续糟配料，混蒸混烧”等特点。由于泥窖是一个相对独立的生态系统，窖内不同空间环境的微生态不同。微生物的生长代谢与环境因素联系紧密，使得窖池中不同酒醅层的发酵效果不同，最终导致不同酒醅层所产原酒存在差异。

目前，酿酒行业普遍认为下层酒醅原酒的酒质优于上层酒醅原酒，但表征其差异性的典型物质及不同醅层原酒风味组的形成机制，依旧是酿酒行业亟待解决的问题。段明松等研究发现上、中、下三层酒醅原酒风味物质总含量依次增高，同时认为乙酯类物质是原酒中的主要呈香物质。王松等利用液液微萃取法（Liquid-liquid microextraction，LLME）结合GC-MS 技术对不同醅层原酒的挥发性物质进行了分析，结果表明，3-甲硫基丙醇、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、糠醇、4-乙基愈创木酚等是最上层酒醅原酒与其余原酒差异性较大的物质。为探究上下醅层原酒产生差异的原因，伊倩倩等将酒醅相关指标与原酒主要风味物质进行了Spearman相关性分析，认为氧气含量是引起不同醅层原酒风味差异的主要原因。唐洁等在清香型小曲酒新工艺研发中探索微生物及环境因子对酒体风味变化的影响，发现环境和微生物因素共同解释了酒醅风味物质的变化，其中水分、酵母总数、还原糖和淀粉是影响酒醅中风味物质的重要因素。这些微环境因子对于微生物及其代谢物的影响，目前尚无定论，还有待进一步研究。但解决问题的关键，首先是着手不同醅层原酒典型风味物质及其差异性分析，为后续深入研究提供理论依据。

本研究采用GC-MS/MS 技术对不同醅层的原酒进行香气成分分析，利用偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLSDA）模型中变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）来筛选对不同醅层原酒具有差异贡献的风味物质，结合香气活度值（odor activity value，OAV）探究引起不同醅层原酒差异的主要风味物质，为揭示浓香型白酒窖内发酵机制及其原酒品质控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：按照“掐头去尾”摘酒工艺从上、下两层酒醅馏酒中摘取的二段、三段浓香型原酒，来自于四川某酒企随机选取五口发酵效果良好的窖池。采取平行取样法进行取样，将相同发酵醅层且相同段次的原酒编为一组，其中上层酒醅原酒编号为U-2 组、U-3 组，下层酒醅原酒编号为D-2 组、D-3组。

试剂：2-辛醇（色谱级），上海安谱有限公司。

仪器设备：8890 气相色谱仪-7000D 三重四极杆质谱检测器（GC/TQ）、Agilent MassHunter 数据采集工作软件，美国Agilent科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样本处理

取980 μL 酒样过0.22 μm 微孔膜，向其中添加20 μL 内标物溶液（2-辛醇，终质量浓度30 mg/L），混合均匀后即可进样。

1.2.2 GC-MS/MS检测

气相色谱条件：Agilent DB-WAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 Micron）；升温程序：35 ℃保持7 min，以7 ℃/min 升至100 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，保持10 min；采用恒流模式，载气（He）流速1.0 mL/min，分流比10∶1，进样量：1 μL，进样口温度220 ℃。

质谱条件：电子轰击（EI）电离源：电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度230 ℃；四极杆温度150 ℃。质量扫描范围m/z 29～500；溶剂延迟：5 min。

1.2.3 风味物质定性与定量方法

采用NIST12 谱库检索定性，首先将谱图进行本底扣除，然后根据有机质谱裂分规律进行谱库检索。原酒中的风味物质定量采用内标法进行半定量，即各成分的峰面积与内标物峰面积之比。

1.2.4 香气活度值计算

香气活度值（OAV）是指某化合物的质量浓度与该物质的嗅觉阈值的比值，可用来表示酒体中香气物质对主体香气成分的贡献，当OAV 大于1时，表明该香气成分对样本香气有直接贡献，当OAV 大于100 时，判断该成分为样品的特征香气成分。

1.2.5 数据处理与分析

采用Excel 2021 对数据进行处理，利用TBtools、Origin 绘制相关图形，应用SIMCA 14.1 软件完成样本的PLS-DA分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵醅层原酒风味组结构特征

通过直接进样结合GC-MS/MS 技术在所有样本中共鉴定出54 种风味物质，其中酯类29 种、醇类12 种、酸类4 种、其他类9 种。基于半定量结果将检出的各类风味物质的含量百分比作堆积柱状图，如图1所示。

图1 不同醅层原酒风味物质构成图

由图1 可以看出，不同醅层原酒均以酯类、醇类、酸类3 种风味物质为主，三类物质总含量占比均在91 %以上，不同醅层原酒在风味组的构成上较相似。各风味组中酯类物质占比最高，均达到67 %以上，且在不同醅层原酒中占比不相同。其中，酯类物质在下层酒醅二段酒、三段酒的占比分别为73.81%、70.73%，在上层酒醅二段酒、三段酒的占比分别为70.55 %、67.75 %，下层酒醅原酒中酯类物质总占比高于上层酒醅原酒。窖泥中的一些产主体香功能厌氧菌逐步向窖池内远端糟醅迁移，在近端糟醅可能会形成功能菌群的优势区，促进了底层、下层等窖池部位糟醅中酯类物质生成。相同段次上层原酒中醇类物质和酸类物质占比均高于下层原酒中的占比，且下层二段酒的醇类物质和酸类物质占比最低，分别为15.75 %、1.79%；上层三段酒的醇类物质和酸类物质占比最高，分别为19.14%、6.06%。

2.2 不同发酵醅层原酒风味组成分分析

不同醅层原酒中检出的风味物质种类存在差异，其中，上层酒醅二段、三段原酒中均检测出51种风味物质，且有2 种是上层酒醅原酒中特有的成分；下层酒醅二段、三段原酒中均检测出52 种风味物质，且有1种是下层酒醅原酒中特有的成分。

将不同醅层原酒中风味物质的含量作热图，如图2 所示。热图能直观的反映酒样中风味物质含量的差异，图中颜色越接近红色说明相对含量越高，颜色越接近蓝色说明相对含量越低。

图2 不同醅层原酒风味物质含量热图

虽然不同醅层原酒在风味组的构成上较相似，但在风味物质的种类及总含量上存在差异，其中，上层酒醅二段、三段原酒中共检测出51 种风味物质，且有2 种风味物质仅在上层酒醅原酒中检出；下层酒醅二段、三段原酒中共检测出52 种风味物质，且有1 种风味物质仅在下层酒醅原酒中检出；上层酒醅二段、三段原酒的风味物质总含量分别为3.55 g/L、3.06 g/L，下层酒醅二段、三段原酒的风味物质总含量分别为5.06 g/L、3.47 g/L。在同段次原酒中下层酒醅原酒的风味物质总含量明显高于上层酒醅原酒，这可能与发酵过程中黄水下渗，黄水中富集一部分风味物质，以及下醅层微环境差异、微生物群落更为复杂的物质代谢等有关。

酯类物质是浓香型白酒中最主要的微量香气成分，其主要代谢途径为：在酰基辅酶A和醇乙酰转移酶的共同作用下进行生物合成，或者酸、醇类物质在酯化酶和脂肪酶的催化作用下反应合成。在不同醅层原酒检测到的29 种酯类物质中，己酸乙酯、乙酸乙酯是不同醅层原酒中含量最高的2 种酯类物质。己酸乙酯作为浓香型白酒的主体香味成分，其含量是判定浓香型白酒品质的重要指标之一。下层酒醅二段、三段原酒中己酸乙酯含量分别为2082.08 mg/L、1517.70 mg/L，上层酒醅二段、三段原酒中己酸乙酯含量分别为1342.64 mg/L、1081.52 mg/L，可以看出己酸乙酯在下层酒醅原酒中的含量高于上层酒醅原酒。乙酸乙酯主要呈现水果香和甜香，其在上层酒醅二段、三段酒中的含量分别为782.23 mg/L、568.33 mg/L，在下层酒醅二段、三段酒中的含量分别为995.06 mg/L、353.45 mg/L。庚酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯等4 种酯类物质在不同醅层原酒中的含量差异显著，其中庚酸乙酯、丁酸乙酯和辛酸乙酯均是下层原酒高于上层原酒，其在下层酒醅二段酒中的含量分别为211.84 mg/L、138.71 mg/L、92.19 mg/L，在上层酒醅二段酒中的含量分别为109.79 mg/L、78.21 mg/L、59.42 mg/L。乳酸乙酯则是上层酒醅原酒中的含量高于下层酒醅原酒，其在上层酒醅二段、三段酒中的含量分别为220.02 mg/L、279.10 mg/L，在下层酒醅二段、三段酒中含量分别为134.05 mg/L、162.38 mg/L。这些酯类物质带有花香、水果香、菠萝香等香气特征，是组成白酒酒体风格的重要香气成分。此外乙酸戊酯、乙酸己酯、戊酸丁酯、戊酸丙酯、己酸异戊酯、己酸戊酯、己酸甲酯、己酸己酯、己酸丁酯、己酸丙酯、庚酸丙酯、丁酸己酯、丁酸丁酯、5-甲基己酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯等酯类物质在下层酒醅原酒中含量均高于上层酒醅原酒。棕榈酸乙酯是一种高级脂肪酸酯，它能增加酒体的醇厚感，降低酒种的干涩味，其在上、下两层酒醅原酒中含量差异显著，在上层酒醅二段、三段原酒中含量分别为6.97 mg/L、5.11 mg/L，在下层酒醅二段、三段原酒中含量分别为1.00 mg/L、0.54 mg/L。棕榈酸乙酯主要来源于大米等酿造原料中脂肪分解的棕榈酸和乙醇在酯酶的作用下合成，上层酒醅氧气充足，霉菌、酵母等微生物代谢旺盛，从而促进棕榈酸乙酯的合成，研究表明棕榈酸乙酯在酸性条件下会被降解，下层酒醅酸度相对较高，导致上层酒醅原酒中棕榈酸乙酯含量高于下层酒醅原酒。

醇类物质在白酒中不仅具有呈香助味的作用，带来醇甜感、使酒体更丰满，同时也是酯类物质形成的前体物质。各原酒中醇类物质均以正戊醇、正己醇、正丁醇、正丙醇、2-丁醇、3-甲基丁醇等6种高级醇为主，其含量之和在醇类物质中的占比均达到93%以上。正己醇和2-丁醇在不同原酒中含量存在明显差异，正己醇具有水果香、花香等特征，在上层二段原酒中含量最高，达到141.77 mg/L，其余原酒中含量在98.29～116.17 mg/L之间。2-丁醇在下层二段原酒中含量最高，达到177.15 mg/L，其余原酒中含量在57.59～75.90 mg/L 之间，呈现麦芽香、烤坚果香。2-己醇仅在上层酒醅二、三段原酒中检测到，其含量分别为3.91 mg/L、1.47 mg/L。分析发现正戊醇、正己醇、正丁醇、3-甲基丁二醇、2，3-丁二醇等醇类物质均是上层酒醅原酒高于下层酒醅原酒，高级醇主要与酿酒酵母的生长代谢有关，主要集中在主发酵过程中产生，由于上层酒醅氧气更充足，酵母菌代谢旺盛，有氧呼吸产生的热量高，发酵温度升高促进高级醇的合成，导致上、下两层原酒中高级醇含量存在差异。

酸类物质同醇类物质一样，也是酯类物质形成的前体物质。主要是由发酵过程中微生物利用淀粉、蛋白质、脂肪等物质通过一系列生化反应生成。白酒中的酸类物质不仅可以助香、维持酯类物质合成平衡、改善白酒风味，同时还具有提升白酒健康成分的作用。乙酸和己酸是上、下醅层原酒中的主要酸类物质，同时也是己酸乙酯、乙酯类物质的前体物质。乙酸主要是由醋杆菌代谢产生，呈现刺鼻的醋香味，是白酒中重要的呈味物质。乙酸在上层二段、三段原酒中含量分别为55.14 mg/L、126.15 mg/L，在下层二段、三段原酒中的含量分别为45.14 mg/L、55.14 mg/L，上层酒醅三段原酒的乙酸含量和其余原酒差异显著。己酸主要由窖泥中的梭菌属细菌代谢产生，具有酸臭味和汗味，能对白酒起到助香作用。该物质的含量在相同段次原酒中呈现下层酒醅原酒高于上层酒醅原酒的情况，其上层二段、三段原酒中的含量分别为14.78 mg/L、23.97 mg/L，在下层二段、三段原酒中的含量分别为25.24 mg/L、32.93 mg/L。

在其他类化合物中的醛酮类化合物也是白酒中重要的呈香呈味物质，主要是由脂肪氧化和氨基酸降解形成。乙缩醛由乙醇和乙醛缩合而成，带有清香味，是本次检测原酒中的主要醛类物质，其含量在不同醅层原酒中差异显著，在下层二段原酒中含量最高，为200.62 mg/L，在上层三段原酒中含量最低，为109.56 mg/L。2-庚酮仅在上层二段、三段原酒中检测到，含量分别为1.22 mg/L、0.54 mg/L。1,2-二甲酰氧基丙烷仅在下层二段、三段原酒中检测到，含量分别为2.72 mg/L、3.54 mg/L。

2.3 不同发酵醅层原酒风味成分的差异贡献度分析

偏最小二乘判别分析（PLS-DA）在样本数量低于变量数时，仍具备较高的操作性与辨识度。对不同醅层原酒进行PLS-DA 分析，结果如图3 所示。通过变量投影重要度（VIP）来表征对白酒风味具有重要作用的风味物质，通常认为VIP 值大于1的变量在不同样本组之间的区分起重要作用。VIP 值越大，说明该风味对区分不同醅层原酒的差异贡献度越大，VIP值＞1的风味物质如表1所示。

表1 基于PLS-DA筛选不同醅层原酒差异风味物质

图3 不同醅层原酒PLS-DA 散点图

由图3可见，4种酒样分别位于4个不同象限并且上层酒样均在X 轴的正半轴，下层酒样均在X 轴的负半轴;Y轴正半轴均是二段原酒，三段原酒均在Y 轴负半轴。结果表明，PLS-DA 能有效区分不同醅层不同段次的原酒。上、下两层原酒分区明显，说明样本间差异较大，可能是酒醅在窖池中所处的空间位置不同，导致不同醅层酒醅的发酵状态不同。

通过VIP 值＞1 筛选出33 种对于不同醅层原酒差异具有重要影响的风味物质，包括酯类24 种、醇类6种、酮类1种、酚类1种、酸类1种。这些风味物质是造成不同醅层原酒差异的主要变量，其中酯类物质的VIP 值相比于醇类、酮类等物质稍高。除了丁酸乙酯（VIP=1.21453）、庚酸乙酯(VIP=1.11091)、乳酸乙酯(VIP=1.09544)、辛酸乙酯(VIP=1.08512)、己酸乙酯(VIP=1.04101)等高含量的酯类物质能表征不同醅层原酒的差异性，棕榈酸乙酯、己酸戊酯、乙酸戊酯、己酸己酯等低含量的风味物质VIP 值也较高，说明微量化合物对于不同醅层原酒差异性的体现同样具有重要意义。

2.4 不同醅层原酒特征风味物质分析

为进一步分析对原酒风味起重要贡献作用的关键香气化合物成分，对已定量的香气成分进行OAV 计算分析，得到32 种OAV＞1 的风味物质，包括酯类16 种、醇类9 种、酸类4 种、醛类1 种、酚类1种、呋喃类1种，结果如表2所示。

由表2 可知，有5 种风味成分OAV＞100，分别是己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯；有13 种风味成分OAV 在10～100 之间，分别是乙酸乙酯、庚酸乙酯、苯乙酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、正戊醇、正己醇、正丁醇、2-丁醇、2，3-丁二醇、己酸、乙缩醛、4-甲基苯酚，以上18 种化合物可认为是对不同醅层原酒香气特征具有重要贡献的风味物质。

表2 不同醅层原酒中OAV＞1的风味物质

分析发现己酸乙酯的OAV 值在各原酒中均最高，符合浓香型白酒的主体香气特征。同时，己酸乙酯（甜香、窖香）、辛酸乙酯（荔枝香）、戊酸乙酯（水果香）、丁酸乙酯（水果香）、3-甲基丁酸乙酯（水果香）均是不同醅层原酒中OAV＞100 的风味物质，并且其OAV 值明显高于其余风味物质，初步认为这5 种酯类物质是不同醅层原酒的共有特征香气成分，说明不同醅层原酒的酒体风格具有一定的相似性。戊酸乙酯在上层酒醅二段原酒中的OAV值高于辛酸乙酯，其他原酒均是辛酸乙酯的OAV值高于戊酸乙酯，说明戊酸乙酯对上层二段原酒的酒体香气特征的贡献度更大。乙酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯、正己醇、正丙醇、3-甲基丁醇、2-丁醇、乙酸等是在不同醅层原酒中含量相对较高的物质，由于其阈值大，香气活度值均较小；3-甲基丁酸乙酯等含量低，阈值大的风味物质，香气活度值却很高。己酸丁酯在下层二、三段原酒中的OAV 值分别为49.68、41.33，在上层酒醅二、三段原酒中的OAV 值分别为18.59、13.60；苯乙酸乙酯在上层酒醅二、三段原酒中OAV 值分别为23.58、33.91，在下层酒醅二、三段原酒中OAV 值分别为5.94、8.33；乙缩醛在上层酒醅二段、三段原酒中的OAV 值分别为81.78、52.42，在下层酒醅二、三段原酒中的OAV值分别为95.99、66.31，说明上、下两层酒醅原酒中同种风味物质对酒体香气特征的贡献度存在一定差异。将OAV 值＞10 和VIP 值＞1 的风味物质结合分析，发现不同醅层酒醅原酒的关键特征物质存在一定差异，其中庚酸乙酯、己酸己酯、己酸为下层酒醅原酒的关键特征风味物质，苯乙酸乙酯为上层酒醅原酒的关键特征风味物质；此外，己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯为不同醅层原酒共有的关键特征风味物质。

3 结论

本研究以不同醅层浓香型原酒为研究对象，应用GC-MS/MS 技术对其进行检测分析，共鉴定出54 种风味物质，其中酯类29 种、醇类12 种，酸类4种、其他类9 种。研究发现酯类物质在不同醅层原酒中占比均最大且存在一定差异，在上层酒醅二段酒、三段酒的占比分别为73.81%、70.73%，在下层酒醅二段酒、三段酒的占比分别为70.55 %、67.75%。不同醅层原酒的风味物质的总含量存在差异，上层酒醅二段、三段原酒的风味物质总含量分别为3.55 g/L、3.06 g/L，下层酒醅二段、三段原酒的风味物质总含量分别为5.06 g/L、3.47 g/L。不同醅层风味物质含量差异的主要原因是：黄水富集了一部分风味物质，且酒醅下层厌氧功能菌代谢更为活跃，从而促进了下层酒醅风味成分的积累。

利用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）提取了对不同醅层原酒具有差异贡献的特征风味物质，通过VIP 值共筛选出33 种对不同醅层原酒具有差异贡献的风味物质，发现酯类物质是对不同醅层原酒的差异贡献最大的风味物质。基于香气活度值（OAV）筛选出32 种OAV＞1 的对白酒风味具有贡献的物质，其中有5 种风味成分OAV＞100，有13种风味成分OAV 在10～100 之间。将OAV 值＞10和VIP 值＞1 的风味物质结合分析，发现庚酸乙酯、己酸己酯、己酸为下层酒醅原酒的关键特征风味物质，苯乙酸乙酯为上层酒醅原酒的关键特征风味物质，己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯为不同醅层原酒共有的关键特征风味物质。此外，2-己醇、2-庚酮、1，2-二甲酰氧基丙烷等不同醅层原酒中特有的风味成分是否会对原酒的风味造成影响还需进一步验证。

浓香型白酒的风味受到原料特性、酿造方式、环境微生物、气候环境等多种因素影响。本次研究也存在一定不足：由于样本数量相对较少，不能完全反映样本间的差异性；由于检测条件有限，对于样本中的微量成分解析还有待深入研究；对于不同发酵醅层原酒风味成分差异的原因及其与微环境、微生物的关系还有待进一步探究。