徐皖玉，冯珣，宋曼铜，张卓，王主

（1.沈阳医学院药学院药学专业2017级1班，辽宁 沈阳110034；2.公共卫生学院卫生化学教研室；3.公共卫生学院实验中心）

奶茶中速溶奶茶是调味茶饮料之一，集牛奶的香甜和红茶的浓郁于一体，近年来受到消费者特别是青少年消费者的喜爱［1］。奶茶中含有生物碱、茶多酚、芳香油等300多种对人体有益的化学成分［2］。其中茶多酚是一类含有多酚羟基的化学物质，包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯等［3］。其结构中的酚羟基可提供活泼氢从而使自由基灭活，例如表儿茶素结构中具有5个酚羟基，因此具有较强的抗氧化活性［4］。茶多酚是茶叶中的活性成分，具有抗菌、抗辐射、抗衰老、抗癌、降血脂、降血压等生理活性［5-6］。咖啡因（1，3，7-三甲基黄嘌呤）是从茶叶和咖啡果中提炼出来的一种黄嘌呤生物碱，既可作为食品的组分，又可以作为药品的原料。咖啡因能够振奋精神，提高注意力，增强自信心，提高工作效率，减少疲乏感，增强识别能力，提高瞬时记忆力；但过量的咖啡因会产生精神依赖［7-8］，因此，对咖啡因的含量进行检测和控制十分必要。本研究选择高效液相色谱法对市售奶茶中的表儿茶素和咖啡因的含量进行了检测，为奶茶的质量评价提供了理论依据，具有一定的实践价值与参考意义。

1 材料与方法

1.1 仪器 LC-16型高效液相色谱仪、SPD-16型紫外检测器、LC-16型高效液相输液泵、CTO-16L柱温箱（日本岛津公司），SI-T246旋涡混合器（美国Scientific Industries公司），KQ-100E超声波清洗器（昆山市超声有限公司），HC-3018高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），JD-100电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

1.2 试剂 甲醇（色谱纯，山东禹王集团），水（屈臣氏饮用水，广州屈臣氏食品有限公司），乙酸乙酯（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），表儿茶素（纯度>98%）、咖啡因（纯度>98%）（中国食品药品检定研究院）。

1.3 样品 立顿日式抹茶奶茶固体饮料15 g（批号：H20848，生产日期：2020年3月27日），立顿经典醇港式奶茶固体饮料15 g（批号：H20050，生产日期：2020年4月2日），立顿经典醇香浓原味奶茶固体饮料15 g（批号：H21802，生产日期：2020年7月4日），立顿经典醇经典原味奶茶固体饮料15 g（批号：H21058，生产日期：2020年10月18日），摩卡麦香奶茶普通型固体饮料15 g（批号：H21456，生产日期：2020年9月17日），摩卡皇家奶茶普通型固体饮料15 g（批号：H20057，生产日期：2020年10月25日），均购自华润万家超市。

1.4 方法

1.4.1 对照品溶液的制备 称取咖啡因、表儿茶素对照品适量，精密称定。分别置于2个不同容量瓶中，加入5%甲醇-水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得2种对照品储备液；再分别精密移取咖啡因和表儿茶素对照品储备液适量，置于同一量瓶中，加5%甲醇-水稀释至刻度，摇匀，即得咖啡因浓度为200μg/ml和表儿茶素浓度为300μg/ml的混合对照品储备液。

1.4.2 供试品溶液的制备 取15g奶茶样品置于烧杯中，以沸水150 ml溶解，自然冷却至室温，即得奶茶混悬液，取该混悬液1 ml置于离心管中，加乙酸乙酯1 ml，涡旋混合5 min，离心（8 000 r/min）20 min，取上清液置于另一离心管中，恒温35℃用氮气吹干，所得残渣加5%甲醇-水1.5 ml，40℃下超声10 min溶解，离心（8 000 r/min）10 min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.4.3 色谱条件及系统适用性试验 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温40℃，流速1.0 ml/min，进样量10μl，检测波长254 nm，采用二元高压梯度洗脱系统，流动相为甲醇-水；梯度洗脱程序见表1；色谱图见图2、图3。

图2 对照品溶液色谱图

图3 供试品溶液色谱图

表1 HPLC梯度洗脱程序

在上述色谱条件下，取供试品溶液进样分析，咖啡因和表儿茶素的理论塔板数均大于20 000，与相邻峰分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 精密吸取“1.4.1”项下混合对照品溶液1.25、2.50、5.00、7.50、10.00 ml，分别置于5个25 ml量瓶中，加5%甲醇-水稀释至刻度，摇匀，作为系列标准溶液。取系列标准溶液与混合对照品溶液，按“1.4.3”项下所述色谱条件进样分析，记录峰面积，以各对照品浓度X（μg/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得出表儿茶素回归方程Y=2.432×104X-9.86×103，相关系数r=0.999 8，线性范围为15～75μg/ml。咖啡因回归方程Y=1.897×104X-6.892×104，相关系数r=0.999 9，线性范围为8～200μg/ml，线性良好。

2.1.2 精密度试验 精密吸取对照品0.4 ml置于5 ml量瓶中加5%甲醇-水稀释至刻度，摇匀，在“1.4.3”项下色谱条件下，重复进样6次，记录色谱峰面积。计算得表儿茶素、咖啡因6次峰面积的RSD均为1.2%，结果表明仪器的精密度良好。

2.1.3 重复性试验 取立顿日式抹茶奶茶固体饮料，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，取6份，按“1.4.3”项下色谱条件分析并计算含量。测得表儿茶素峰面积的RSD为1.5%，咖啡因峰面积的RSD为0.9%，结果表明方法的重复性良好。

2.1.4 加样回收率试验 精密量取已知含量的立顿日式抹茶奶茶固体饮料样品10.00 ml，共9份，每组按低、中、高浓度分别加入一定量的对照品，每一浓度3份，按“1.4.2”项下方法操作，按“1.4.3”项下色谱条件下测定，计算咖啡因和表儿茶素的回收率和RSD，结果见表2。

表2 加样回收率试验（n=3）

2.1.5 稳定性试验 取立顿日式抹茶奶茶固体饮料样品，按“1.4.2”项下方法制备，将其置于4℃冰 箱 中，分 别 于0、2、4、8、10、12 h在“1.4.3”项下色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积。测得表儿茶素峰面积的RSD均小于1.0%，咖啡因峰面积的RSD为1.6%，表明供试品溶液在4℃避光条件下12 h内稳定。

2.2 表儿茶素和咖啡因含量的测定 精密量取不同品牌奶茶样品，按“1.4.2”项下方法制备样品溶液，按“1.4.3”项下色谱条件测定，每批样品测定3次，计算奶茶样品中表儿茶素和咖啡因物质的含量，结果显示，只有立顿日式抹茶奶茶中检测到表儿茶素，其含量为23.87 mg/kg，其它样品中未检出表儿茶素，所有奶茶样品均检测到咖啡因。见表3。

表3 表儿茶素和咖啡因含量测定结果（mg/kg，n=3）

3 讨论

3.1 样品预处理

3.1.1 预处理方法选择 采用三氟乙酸-盐溶液乙醇法、乙酸+乙醇法去除样品中的蛋白质，取与样品等体积的溶液进行去除蛋白质，经离心发现难以得到澄清的上清液，经有机滤膜过滤，由于上清液中奶茶杂质过多，通过不了滤膜。经研究发现，向奶茶样品中加入乙酸乙酯，摇匀、离心后可以得到澄清的上清液，将上清液收集后经氮吹仪吹干后得到得到白色晶体。故最后采用乙酸乙酯液-液萃取法进行奶茶样品预处理。

3.1.2 供试品制备条件的选择 选用乙酸乙酯为提取溶剂，考察提取时间分别为10、20和30 min时对奶茶样品提取的影响，结果表明，提取20 min效果较好，杂质峰较少，各主要色谱峰分离度良好且峰面积较大。提取时间为10 min时，有乳化现象，提取不完全；提取时间为30 min时，提取效果与20 min的提取效果相似，但耗费时间。因此提取时间选用20 min。选用乙酸乙酯为提取溶剂，提取时间为20 min。经乙酸乙酯20 min提取后得到的澄清液吹干后所得到的结晶，使用甲醇在常温下复溶不能溶解，所以采用超声清洗方法，同时，超声清洗时常温下溶解效果不佳，将其温度调至40℃是溶解效果较好。制备后的供试品在常温下瓶内也会出现絮状物，所以，进样时的柱温也选择40℃。

3.2 色谱条件考察

3.2.1 流动相系统的选择 本文考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-2.0%乙酸水和甲醇-0.03%磷酸水等流动相系统，结果显示，采用甲醇-水系统为流动相时，色谱图基线平稳、各峰分离度较好。与乙腈系统相比，甲醇系统中各主要色谱峰的保留时间分布较均匀。水效果要比0.2%甲酸和2.0%乙酸好。因此，选择甲醇-水作为流动相。

3.2.2 梯度洗脱程序的选择 色谱柱Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温40℃，流速1.0 ml/min，进样量10μl，检测波长254 nm，采用二元高压梯度洗脱系统，流动相5%甲醇水。在此条件下，色谱图基线平稳、各峰分离度较好，主要色谱峰的保留时间分布较均匀。

3.3 不同品牌奶茶固体饮料中表儿茶素和咖啡因的含量测定 在6种不同固体奶茶饮料中均检测出咖啡因，其含量在89.9～414.6 mg/kg之间；而只在1种奶茶固体饮料中检测到表儿茶素，其含量为23.87 mg/kg，其他5种奶茶固体饮料中均未检测出茶多酚类物质。