王怡云,石丽敏,谢俊霞

(青岛大学脑科学与疾病研究院(山东省神经相关疾病的机制与防治重点实验室，山东省沿海地区神经退变疾病协同创新中心),山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是全球第二大神经退行性疾病，其病理特征为中脑黑质(SN)区多巴胺(DA)能神经元选择性死亡，残存的DA能神经元出现以α-突触核蛋白(α-syn)为主要成分的路易小体[1-3]。PD主要的临床症状有静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势反射障碍等[4-6]。但到目前为止，PD病因及发病机制尚不明确，可能与遗传、环境、铁沉积、氧化应激、线粒体功能障碍等原因有关[7-11]。钾通道是目前发现的亚型最多、功能最复杂、分布最广的一类离子通道，几乎存在于所有生物体中[12]。近年来有文献报道，钾通道的异常表达可能对PD有一定的调控作用[13]。A型钾通道是电压依赖型钾通道的一个重要分支，在调控DA能神经元的动作电位、放电模式和放电频率上具有重要的作用[14]。A型钾通道共有5种亚型，有研究表明，Kv4.3 A型钾通道在SN区DA能神经元上广泛表达[15]。有研究对PD病人残存的DA能神经元进行PCR分析，发现Kv4.3mRNA表达明显升高[16]，而阻断A型钾通道可以改善PD病人[17]以及PD大鼠模型[18]的运动功能障碍。然而，在PD疾病进展过程中A型钾通道的表达变化目前尚不清楚。本实验在携带人A53T突变型α-syn的转基因小鼠(α-SynA53T+/+小鼠)上，应用蛋白免疫印迹方法检测了不同月龄的α-SynA53T+/+小鼠以及同窝野生型(WT)小鼠SN区Kv4.3和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达水平，探究在PD的进展过程中A型钾通道的变化，为PD提供潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 所用A53T转基因小鼠购自美国Jackson实验室。α-SynA53T+/-小鼠与α-SynA53T+/-小鼠杂交得到下一代小鼠，通过基因组鉴定得到α-SynA53T+/+小鼠、α-SynA53T+/-小鼠及相对应的同窝WT小鼠。本实验选用3月龄和15月龄α-SynA53T+/+小鼠和同窝WT小鼠作为研究对象，每组6只。小鼠饲养条件：室温(21±2)℃，湿度(50±5)%，12 h昼夜循环光照，可自由饮水、取食。

1.1.2实验仪器及试剂 Kv4.3抗体购自中国Absin公司，TH抗体购自美国Millipore公司，β-actin抗体购自中国博奥森公司。山羊抗兔二抗购自中国Absin公司。分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液均购于康为公司，ECL发光液、PVDF膜购自美国Millipore公司，APS、TEMED、RIPA裂解液、BCA试剂盒、Loading buffer购自中国碧云天公司。电泳仪、电转仪购自美国BioRad公司，凝胶成像系统购自美国UVP公司。

1.2 蛋白免疫印迹法检测SN区TH和Kv4.3蛋白的表达

小鼠用100 g/L水合氯醛麻醉后快速断头取脑，完整地取出包括中脑SN区的脑组织，置于冰盒内，取出双侧SN区域，分别放入预冷的1.5 mL EP管中，准确称质量。加入蛋白裂解液充分研磨后，于冰上静置30 min，在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，将上清转移至新的EP管中，应用BCA法，测定波长562 nm处的吸光度值，根据标准品的吸光度绘制标准曲线，计算待测样品的蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，按照样品上样量准确上样，蛋白经SDS-PAGE电泳后，湿转到PVDF膜上，转膜完成后，将目的条带完整切下，用50 g/L的脱脂奶粉于室温摇床上封闭2 h；分别加入一抗Kv4.3(1∶1 000)、TH(1∶3 000)以及β-actin(1∶10 000)，于4 ℃摇床上低速摇动孵育过夜。用TBST洗3次，每次10 min，加山羊抗兔(1∶10 000)的二抗在室温下孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min。于ECL显色试剂盒中取适量发光液均匀滴在PVDF膜上，室温孵育1 min，用UVP凝胶成像系统拍摄图片。在Image J图像采集与分析软件上对条带进行灰度值分析。用Kv4.3、TH蛋白与β-actin的比值作为目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 不同月龄α-Syn A53T+/+小鼠SN区Kv4.3蛋白表达比较

α-SynA53T+/+组和WT组3月龄小鼠Kv4.3蛋白表达水平分别为0.965±0.040和0.844±0.084(n=6)，差异无统计学意义(t=1.402，P>0.05)。α-SynA53T+/+组和WT组15月龄小鼠Kv4.3蛋白表达水平分别为1.855±0.101和1.343±0.124(n=5)，α-SynA53T+/+组Kv4.3蛋白表达明显上调，差异具有统计学意义(t=3.202，P<0.05)。

2.2 不同月龄α-Syn A53T+/+小鼠SN区TH蛋白表达变化

α-SynA53T+/+组和WT组3月龄小鼠TH蛋白表达水平分别为1.030±0.099和0.928±0.135(n=5)，差异无统计学意义(t=0.612，P>0.05)。α-SynA53T+/+组和WT组15月龄小鼠TH蛋白表达水平分别为1.586±0.1205和1.975±0.1008(n=6)，α-SynA53T+/+组TH表达明显下调，差异具有统计学意义(t=2.475，P<0.05)。

3 讨 论

近年来的研究显示，PD的发病可能与钾离子通道功能异常有关，以钾离子通道为靶点来治疗PD也成为一个重要的研究方向[19]。钾离子通道广泛存在于神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞、红细胞、平滑肌细胞和淋巴细胞等多种细胞中[20-21]。A型钾通道是一种电压依赖型钾通道，又称瞬时外向型钾通道，在SN区DA能神经元上有广泛的表达，可影响神经元的自发放电[22-24]。该通道介导的电流具有瞬时出现、快速激活、快速失活等特点[25-26]。A型钾通道由Kv4基因家族形成的α亚基和KChip基因家族形成的辅助β亚基共同组成，其中在SN区DA能神经元上主要表达的是Kv4.3/KChip3.1[27-29]。然而，在PD的SN区DA能神经元退行性变过程中，A型钾通道究竟发挥了何种作用尚不清楚。

本实验选取α-SynA53T+/+小鼠作为动物模型，该模型可用来研究PD发病过程中运动及非运动行为的改变[30]。本文研究结果显示，3月龄的A53T转基因小鼠SN区Kv4.3及TH蛋白的表达水平尚未发生明显变化，提示3月龄的A53T转基因小鼠SN区并无损伤，A型钾通道也尚未发生变化。有文献报道，3月龄A53T转基因小鼠运动协调能力无明显障碍，但认知功能出现一定程度的下降[31]。另有研究表明，A53T转基因小鼠在8月龄时才出现明显的总体运动功能障碍，表现为毛发梳理减少、移动减少，在12月龄时表现出步幅的缩短和速度的减慢[32-33]。本研究在15月龄的A53T转基因小鼠SN区检测到，Kv4.3蛋白的表达显著升高，TH蛋白的表达显著降低，说明SN区的DA能神经元出现了一定程度的损伤，A型钾通道的表达也出现了异常，该结果与以往研究PD病人存活的SN区DA能神经元中Kv4.3mRNA的表达显著增加相吻合[16]。

钾离子通道的表达及功能异常通过多种机制影响SN、纹状体的功能，从而在PD的发病中发挥重要作用。例如，近期已有研究结果显示，钙激活型钾通道KCa3.1在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型SN区表达显著增加，基因敲除或用通道阻断剂药理干预能有效拮抗MPTP诱导的SN区DA能神经元损伤及纹状体DA含量下降，减轻小胶质细胞增生所导致的炎症反应[34]。ATP敏感性钾通道(KATP)的SUR1亚单位在PD小鼠模型SN区的表达也显著增高[35]，激活KATP可以导致DA能细胞内铁含量增加，损伤线粒体功能并增加细胞氧化应激[36]。本实验首次证明，在15月龄的A53T转基因小鼠SN区A型钾通道Kv4.3蛋白表达增加。A型钾通道是调节SN区DA能神经元兴奋性的关键因素，可影响突触传递和神经递质释放。我们的前期研究已经观察到，A型钾通道阻断剂4-氨基吡啶可以抑制A型钾通道电流，增加SN区DA能神经元自发放电频率[37]；腹腔注射4-氨基吡啶能显著缩短MPTP诱导的PD小鼠模型爬杆实验中转头和爬杆的时间，改善PD小鼠的运动障碍[38]。因此，我们推测，在PD的进展过程中，A型钾通道的表达及功能发生改变，影响SN区神经元的兴奋性，进而改变了纹状体DA的释放，从而影响机体的运动功能。本实验结果为阐明A型钾通道参与PD发病提供了初步的实验证据。