迟晓琦,李浩然,吴雪,张文秀,韩晓华

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

高血压是一种以血压持续升高为主要临床表现的心血管疾病，具有很高的发病率和致残率[1-3]。长期的高血压会导致血管结构和功能的改变，即血管重构[4]，而后者是导致高血压重要靶器官(如心、脑、肾等)损伤的关键病理生理学基础[5]。肾素-血管紧张素系统(RAS)对心血管功能具有重要的调节作用[6]。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分，可以通过诱导血管收缩和外周血管阻力增加升高血压；此外，AngⅡ对血管平滑肌细胞(VSMCs)具有重要的调节作用，可通过促进VSMCs的增殖、迁移和血管外基质分泌等作用，促进血管重构的发生[7-8]。在自发性高血压大鼠(SHR)血浆和心血管组织中AngⅡ水平明显升高，提示AngⅡ可能是促进高血压形成和发展的重要因素[9]。

ANO1是2008年发现的钙激活氯通道，在心血管系统中有广泛的表达[10-11]。ANO1参与血管舒缩功能的调节已有较多报道[12-14]，这可能是由于ANO1激活导致VSMCs内Cl-外流和膜除极，进而激活细胞膜电压依从性钙通道，触发胞外钙内流和血管收缩，但是ANO1和血管重构的关系报道较少。有研究发现，ANO1参与了肾型高血压大鼠大脑中动脉血管重构的形成[15]； ANO1能通过血管重构促进肺动脉高压(PH)的形成[16]；在野百合碱和低氧诱导的大鼠PH模型中，ANO1被证实是肺动脉VSMCs的钙激活氯通道，且高表达的ANO1通过促进血管收缩和血管重构参与PH的形成[14]。WANG等[17]的研究结果表明，ANO1在SHR的血管组织和VSMCs中均呈高表达，并参与了SHR高血压的形成，但是诱导ANO1高表达的因素并未被阐明。根据前期研究，我们推测AngⅡ可能通过促进VSMCs的ANO1蛋白表达，参与对VSMCs功能调控。因此，本实验利用原代培养的大鼠胸主动脉VSMCs，观察AngⅡ上调ANO1表达的量-效和时-效关系，并进一步探讨AngⅡ作用的受体机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

AngⅡ、血管紧张素Ⅰ型受体(AT1R)阻断剂氯沙坦钾(LP)和血管紧张素Ⅱ型受体(AT2R)阻断剂PD123319(PD)由ApexBio公司提供，ANO1抗体购自Abcam公司，β-actin抗体购自北京博奥森公司，DMEM高糖培养粉购自Gibco公司，胎牛血清购自美国BI公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Thermo公司，RIPA裂解液由碧云天生物科技研究所提供，其他试剂均为国产分析纯。实验仪器包括CO2培养箱、无菌超净工作台、Eppendorf高速离心机、SpectraMax M5多功能酶标仪、微量分析天平以及Western显影仪等。

1.2 VSMCs的原代培养

实验选用体质量80～100 g的Wistar大鼠，采用组织贴块法进行VSMCs的原代培养[18-20]。大鼠以80 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用体积分数0.75的乙醇消毒，迅速剥离胸主动脉，转移到提前加入培养液的预冷玻璃皿中，清理血管内的血液及血管外筋膜，轻轻刮去内皮，将血管条剪成约1 mm3的小块，铺于培养瓶底部，加入含体积分数0.20胎牛血清的DMEM培养液4 mL，垂直放入CO2培养箱中，静置4～5 h后翻瓶，培养约1周后VSMCs在血管块周围长出，选5～8代细胞进行后续实验。

1.3 实验分组

实验1将VSMCs分为对照组(加入无血清培养液处理)和AngⅡ组(分别加入1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ)，处理24 h后观察AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响。实验2分为对照组(加无血清培养液)和AngⅡ组(加入100 nmol/L AngⅡ)，观察AngⅡ作用不同时间(1、6、12、24、48 h)对ANO1蛋白表达的影响。实验3分为对照组(加无血清培养液)、AngⅡ组(加100 nmol/L AngⅡ作用24 h)、AngⅡ+LP组(AngⅡ处理前加入1 μmol/L LP)、AngⅡ+PD组(AngⅡ处理前加入1 μmol/L PD)，观察AngⅡ受体阻断剂对ANO1蛋白表达的影响。

1.4 Western blot检测

药物处理结束后以RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。样品均以20 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，加100 g/L脱脂奶粉在室温下摇床慢摇封闭60～120 min，分别加入ANO1(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，在4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗，在室温下摇床慢摇孵育1 h，TBST再洗膜3次后，用ECL发光液显影。用Image J软件分析条带的灰度值，结果以ANO1/β-actin比值表示。实验重复3～4次，取平均值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 不同浓度AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响

对照组ANO1蛋白表达水平为0.78±0.02，以1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ处理细胞24 h后，ANO1蛋白表达水平分别升高至0.85±0.05、0.92±0.03、1.14±0.10、0.95±0.02和0.91±0.02(n=3，F=18.56，P<0.01)。在各浓度组中，以10、100和500 nmol/L AngⅡ组的改变具有统计学意义(q=4.866～12.820，P<0.01)，且以100 nmol/LAngⅡ作用最为显著(图1)。

Con为对照组；1、10、100、500、1 000分别表示AngⅡ的浓度为1、10、100、500、1 000 nmol/L。

2.2 AngⅡ作用不同时间对ANO1蛋白表达影响

对照组ANO1蛋白表达水平为1.00±0.09，以100 nmol/L AngⅡ处理1、6、12、24、48 h后，ANO1蛋白表达水平分别升高至1.05±0.17、1.28±0.30、1.65±0.28、1.82±0.14和1.58±0.12(n=4，F=10.84，P<0.01)，其中AngⅡ作用12、24和48 h后，ANO1蛋白的表达显著增加(q=5.661～8.053，P<0.01)。见图2。后续实验选用100 nmol/L的AngⅡ处理24 h进行观察。

Con为对照组；1、6、12、24、48分别示AngⅡ作用1、6、12、24、48 h。

2.3 AngⅡ受体阻断剂对AngⅡ诱导的ANO1蛋白表达的影响

对照组、AngⅡ组、AngⅡ+LP组和AngⅡ+PD组细胞蛋白表达水平分别为1.00±0.19、1.45±0.14、0.95±0.16和1.41±0.06(n=3，F=9.68，P<0.05)。与对照组相比，AngⅡ组ANO1蛋白表达水平升高(q=5.313，P<0.05)；与AngⅡ组相比，AngⅡ+LP组ANO1蛋白表达降低至对照组水平(q=5.872，P<0.05)，而AngⅡ+PD组ANO1蛋白的表达水平无明显改变(q=0.452，P>0.05)。结果提示AT1R阻断剂LP能够完全阻断AngⅡ诱导的ANO1蛋白表达，而AT2R阻断剂PD则无此作用。见图3。

Con为对照组。

3 讨 论

AngⅡ是RAS的主要活性物质[21]，也是公认的诱导高血压发生发展的关键致病因素。系统或血管局部生成的AngⅡ，不仅可以通过诱导血管平滑肌收缩和外周阻力增加升高血压，还可以通过刺激VSMCs异常增殖、迁移和细胞外基质形成，促进高血压血管重构的发生发展[8,22]。AngⅡ主要通过结合AT1R或AT2R发挥作用[23]。AngⅡ与AT1R结合后，可激活磷脂酶C(PLC)/三磷酸肌醇(IP3)信号通路，通过肌质网内钙释放，导致胞内钙水平升高，AngⅡ也可以激活AKT、ERK、RhoA/ROCK信号途径以及升高胞内活性氧(ROS)等多条途径，参与对VSMCs的功能调控[24]。AngⅡ对AT2R的亲和力较低，一般认为AngⅡ与AT2R结合可拮抗其与AT1R结合所产生的效应[25]。

ANO1是血管平滑肌上的钙激活氯通道[26]，可参与血管功能和血压的调节，并且和高血压的血管重构密切相关。一项针对SHR的研究表明，ANO1在血管组织和原代培养的VSMCs中均高表达，并且参与了SHR高血压的形成[17]。由于SHR血循环和血管组织局部RAS过度激活已有报道[9]，且WÖSTEN-VAN ASPEREN等[27]研究发现，AngⅡ能够增强ANO1依赖性钙激活氯电流，因此我们推测AngⅡ很可能促进了VSMCs中的ANO1蛋白表达，进而参与AngⅡ对VSMCs的功能调控。

本研究首先利用组织贴块法进行VSMCs的原代培养，然后通过将不同浓度AngⅡ加入VSMCs作用不同时间，观察AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响。研究结果显示，AngⅡ能够明显促进VSMCs的ANO1表达，并且呈明显的剂量和时间依赖性。而通过利用特异性的血管紧张素受体阻断剂，本研究进一步明确了AngⅡ上调ANO1的作用是通过与AT1R结合而实现的。钙激活氯通道ANO1是心血管领域的一个新的研究热点，本研究通过探讨AngⅡ对VSMCs中ANO1表达的影响及受体机制，为进一步明确ANO1可能参与AngⅡ诱导的VSMCs功能异常提供了前期的实验依据。目前，临床上对高血压血管重构的预防和治疗效果并不理想，而对ANO1的深入研究，可能为高血压血管重构的防治提供新的思路。