唐培培郝浩浩吴俊林周权李昂姜山刘哲陈剑晖李翔*马金婷王杭肖金胜贾峰

（1河南省烟草公司驻马店市公司，河南驻马店 463000；2河南省驻马店市烟草公司泌阳县分公司，河南泌阳 463700；3湖北中烟工业有限责任公司襄阳卷烟厂，湖北襄阳 441000；4河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

烟草是一种需钾量很大的作物，烟叶含钾量是衡量烟叶品质的重要指标之一[1]。但我国北方烟区的烟叶含钾量大多不足2%[2]，直接影响烟叶品质。提高烟叶钾含量的方法主要有增加外施钾肥[3]和提高钾离子吸收[3]。烟叶AKT1基因具有对钾离子高亲和力吸收的作用[4]，AKT1蛋白主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上，具有特定的保守域和Ion-trans结构[5]，在植物钾的吸收转运中发挥作用[6]，介导了从低浓度钾溶液中吸收钾离子[7]。AKT1蛋白也可提高植株对NH4+的吸收[6]，在健壮烟苗的根部其表达量较高[8-9]。打顶后24 h内烟草钾离子通道基因在叶中表达量高于根，有利于钾元素向叶中分配[10]。本研究旨在通过分析烟草中钾离子通道基因和蛋白的生物信息学特点，为利用分子技术提高烟叶钾含量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据获取

分别在 NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/）、茄科数据库（https：//solgenomics.net/）以及 Nicotiana atttenuata Data Hub（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/）下载9个拟南芥、9个烟草和2个番茄的AKT1基因或蛋白序列。

1.2 蛋白质理化性质、蛋白结构及疏水性分析

采用ExPaSy在线软件Protparam（http：//web.exp asy.org/protparam/）分析蛋白序列的等电点、分子量和脂肪族氨基酸指数等性质[11]。利用TMHMM网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白的跨膜结构数量。利用SOPMA网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISSMODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白质二级和三级结构。利用Expasy ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）预测蛋白的疏水性。

1.3 AKT1蛋白磷酸化位点分析

利用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）分析蛋白的磷酸化位点，包括丝氨酸（Serine）、苏氨酸（Threonine）和酪氨酸（Tyrosine）。

1.4 烟草AKT1基因的组织表达差异分析

利用Nicotiana atttenuata Data Hub中Expression中 Gene expression（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/chart/expression_genes）分析基因的组织表达量。

1.5 数据统计

试验数据用Excel 2016和PASW Statistics 18.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 钾离子通道蛋白理化性质分析

钾离子通道相关蛋白的理化特性结果如表1所示。可以看出，共筛选出烟草、拟南芥和番茄钾离子通道蛋白20个，氨基酸数目范围为662～2 655个，其中6个烟草钾离子通道蛋白的氨基酸数目较多，平均2 250个氨基酸，而拟南芥和番茄钾离子通道蛋白的氨基酸数目平均为805个。20个钾离子通道蛋白的氨基酸数量及其分子量差异较大；钾离子通道蛋白酸性和碱性各10个，其中，9个烟草钾离子通道蛋白中，6个为碱性，3个为酸性。钾离子通道蛋白平均每100个氨基酸中带负电荷残基的总数（Asp+Glu）为10.24个，钾离子通道口附近有带负电荷的残基，可提高局部阳离子浓度而降低阴离子浓度[12]；每100个氨基酸中带正电荷残基的总数（Arg+Lys）为10.95个，正电荷残基对减缓钾离子通道的宏观失活具有重要作用[13]。9个烟草钾离子通道蛋白中5个稳定，4个不稳定；9个拟南芥钾离子通道蛋白中6个稳定，3个不稳定，2个番茄钾离子通道蛋白中稳定与不稳定各1个。20个蛋白的脂肪族氨基酸指数平均为97.18。

表1 钾离子通道蛋白理化性质与二级结构含量

烟草钾离子通道蛋白有5个为疏水性，4个为亲水性；前人研究认为烟草钾离子通道中布满疏水氨基酸[12]，且氨基酸的疏水特性对钾离子通道的正常失活也很重要[13]。一般认为钾离子通道蛋白至少有4个跨膜结构。9个烟草钾离子通道蛋白中3个短的通道蛋白有5个跨膜结构，6个长的通道蛋白有9～27个跨膜结构；而9个拟南芥钾离子通道蛋白有7个为5个跨膜结构，其余2个分别为 6、7个跨膜结构；2个番茄钾离子通道蛋白分别为3、5个跨膜结构。

2.2 钾离子通道蛋白二级结构和三级结构预测分析

对钾离子通道蛋白二级结构的预测见表1，烟草和拟南芥钾离子通道蛋白α-螺旋的平均含量分别为37.99%和44.70%，延伸链的平均含量分别为22.94%和16.02%，β-转角的平均含量分别为8.15%和6.15%，无规则卷曲平均含量分别为30.92%和33.13%。这20个蛋白的疏水性为-3.14～3.12，整体比较平衡。

由烟草NIATv7_g04651钾离子通道蛋白三级结构的预测结果可看出，该蛋白由4个亚基组成，一半作为跨膜结构通道，一半在膜外作为辅助开关结构（图1），与前期钾离子通道蛋白通常由4个相同的亚基组成研究结论一致[14]。此结构可以及时关闭通道，使胞内的钾离子不能释放到细胞外。

图1 烟草NIATv7_g04651钾离子通道蛋白三级结构预测

2.3 钾离子通道蛋白磷酸化位点预测分析

蛋白质磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，在细胞信号转导过程中有重要作用。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627等3个烟草钾离子通道蛋白的磷酸化位点在蛋白两端分布比较密集，在中间分布相对稀疏，可能在蛋白的两端更利于磷酸化的执行，从而调控蛋白执行相应功能。

2.4 钾离子通道相关基因的组织表达差异分析

烟草钾离子通道相关基因的组织表达差异结果如表2所示，NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3个基因均在种子中有比较高的表达；NIATv7_g04651基因主要在花器官中表达，具体在花粉管、花药、晚期花冠以及开放的花朵中有较高的表达；NIATv7_g07244基因除了在种子中高表达之外，也在柱头和花蕾中有较高的表达，但是该基因在其他器官中整体表达量比较低；NIATv7_g14627基因除了在种子中高表达之外，也在根、茎、叶中有较高的表达，其他器官中表达量处于中等水平。结果表明，钾离子通道基因在器官中表达具有特异性，即在不同的器官组织中，有不同的钾离子通道基因起作用，在不同生长发育阶段有不同钾离子通道基因发挥作用。

3 结论

本研究发现，9个烟草钾离子通道蛋白中6个为碱性，3个为酸性；5个为疏水性蛋白，4个为亲水性蛋白。烟草NIATv7_g04651钾离子通道蛋白由4个亚基组成，一半作为跨膜结构通道，一半在膜外作为辅助开关结构。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3个蛋白的磷酸化位点在蛋白两端分布较密集，在中间分布相对稀疏；NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627这3个基因的组织表达具有特异性，在不同生长发育阶段有不同钾离子通道基因发挥作用。