石巍,王俊耐,张慧芳

(郑州大学第三附属医院妇产科,河南 郑州 450000)

卵巢癌作为一种常见女性恶性肿瘤，发病隐匿，病死率高[1]。而卵巢癌以化疗为主的治疗手段因耐药性其效果不容乐观[2]。故有必要通过对卵巢癌发病机制的探究，寻找新型的肿瘤治疗方法。ErbB2基因又称HER2，隶属于表皮生长因子受体家族[3]。ErbB2基因常高表达于肿瘤细胞中[4]，而且PI3K/Akt信号转导途径活性较高[5]，导致肿瘤细胞恶性程度极高，提示肿瘤病人转移率高、存活期缩短。而PI3K/Akt/eNOS信号通路是一种经典的抗细胞凋亡的信号转导途径，该通路异常已被证实在众多恶性肿瘤的发生、转移及放化疗抵抗中发挥关键作用[6-7]。PI3K抑制剂可有效抑制癌细胞增殖从而促进细胞凋亡，进而发挥肿瘤治疗作用[8]。然而，目前关于ErbB2基因是否影响卵巢癌细胞生物学特性以及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的机制的研究未见报道。因此，本研究期望通过基因沉默技术，探究ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性的影响及可能机制，以期为卵巢癌分子靶向治疗提供潜在证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人卵巢癌细胞株HO8910细胞(上海生物工程研究所提供)；RPMI-1640和DMEM(Gibco公司，美国)；RNA提取试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司)；紫外线分光光度仪(上海奥析科学仪器有限公司)；ABI PRISM®7300系统(ABI，USA)；BCA试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；Wes-tern blot蛋白检测的兔多克隆一抗和山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司，Cambridge，MA，USA)；噻唑蓝(MTT)溶液(Sigma公司，USA)；自动酶标读数仪(BIO-RAD公司，USA)；ECL化学发光检测试剂盒(Sigma公司，USA)；Annexin V-FITC/PI双标染色试剂盒(BestBio公司，上海)；流式细胞仪(BD公司，USA)；Matrigel基质胶(BD公司，USA)；Transwell小室(康宁公司，USA)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及其分组处理 人卵巢癌细胞株HO8910细胞培养于含有体积分数0.1胎牛血清的RPMI-1640培养基中。以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度的孵箱中培养。待细胞铺满培养板80%～90%做传代培养。弃培养液，PBS洗2次，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，传代培养。

本实验siRNA序列设计参照Genbank中报道的ErbB2的mRNA全序列，并由上海生工生物工程技术服务有限公司对所有片段进行合成。选取对数生长期的HO8910细胞分为5组：空白对照组(A组：不转染任何序列)、阴性对照组(B组：转染空载体质粒)、siErbB2组(C组：转染siRNA序列)、wortmannin组(D组：转染PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂wortmannin)、siErbB2+IGF-1组(E组：转染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信号通路激动剂IGF-1)。

1.2.2实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 采用RNA提取试剂盒抽提总RNA。采用紫外线分光光度法检测组织和细胞中RNA的纯度及浓度。设计ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。逆转录参照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer说明书进行。取反应液进行荧光定量PCR操作。在ABI PRISM®7300系统中进行荧光定量PCR。以2-ΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系。其计算公式如下：ΔCt=CtmiRNA-CtU6，分别计算细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表达量。

1.2.3Western blot检测 在细胞中加入蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min；4 ℃下12 000 r/min离心20 min。取上清液采用BCA试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。本实验所用一抗为兔多克隆抗体ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。孵育后，室温下PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。在暗室环境中用线片曝光，显影、定影之后观察结果。以GAPDH作内参照，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。

1.2.4MTT法检测 转染24 h后，取对数生长期的细胞，调整细胞密度制备细胞悬液后，接种到96孔培养板，根据实验分组，每组各设3个复孔，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2细胞培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96 h时取出培养板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL继续培养4 h终止培养，弃上清液，每孔加150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，使紫结晶充分溶解。采用自动酶标读数仪于570 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。最后根据所采集值，计算HO8910细胞的生长抑制率，绘制生长曲线。

1.2.5流式细胞术检测 细胞转染48 h后，收集细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，调整细胞的密度。检测前先离心10 min，弃上清后加入预冷的体积分数0.70乙醇溶液固定细胞，4 ℃过夜。用100目的尼龙网过滤。离心弃上清，加入100 μL的RNA酶溶液。然后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL 的PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488 nm检测细胞凋亡情况。

1.2.6Transwell实验 取Transwell小室及实验所需试剂温育后，制备细胞悬液，调整细胞密度。首先于24孔板底部加入含体积分数0.10胎牛血清的培养基平衡，取配制细胞悬液加入Transwell小室，孵育过夜。培养24 h后，取出Transwell小室，吸干上室固定液，行甲紫染色。轻擦去上室内面未穿膜的细胞，光镜下计算细胞穿膜数。细胞侵袭实验用Matrigel稀释液模拟细胞外基质，观察细胞穿透向外浸润的能力。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 转染后各组细胞相关信号通路因子mRNA和蛋白表达的变化

单因素方差分析显示，5组间mRAN和蛋白表达量差异具有统计学意义(F=3.58～8.69，P均<0.05)。两两比较显示，与空白对照组比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中的Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著下降(P均<0.05)，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加(P均<0.05)；siErbB2组ErbB2的mRNA和蛋白表达量则显著下降(P均<0.05)；与siErbB2组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量则显著下降(P均<0.05)。见图1。

①各组细胞转染后mRNA表达的qRT-PCR检测；②、③各组细胞转染后蛋白表达的Western blot检测。A：空白对照组；B：阴性对照组；C：siErbB2组；D：wortmannin组；E：siErbB2+IGF-1组。与空白对照组相比，*P<0.05；与siErbB2组相比，#P<0.05。

2.2 转染后各组细胞的增殖变化

MTT法检测结果的单因素方差分析显示，5组间的细胞增殖差异有统计学意义(F=8.84，P<0.05)。两两比较的结果显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞增殖较慢(P均<0.05)；与siErbB2组比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖增加(P<0.05)。析因设计方差分析结果显示，F组别=7.31，P=0.002；F时间=10.49，P<0.001；F组别×时间=5.78，P<0.05。见图2。

①细胞增殖率柱状图；②A值变化折线图。A：空白对照组；B：阴性对照组；C：siErbB2组；D：wortmannin组；E：siErbB2+IGF-1组。与空白对照组相比，*P<0.05；与siErbB2组相比，#P<0.05。

2.3 转染后各组细胞凋亡变化

单因素方差分析显示，5组的凋亡率差异有统计学意义(F=9.46，P<0.05)。两两比较显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞凋亡率均明显上升(P均<0.05)；对比siErbB2组，siErbB2+IGF-1组凋亡率明显下降(P<0.05)。见图3。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：siErbB2组；D：wortmannin组；E：siErbB2+IGF-1组。

2.4 转染后各组细胞迁移与侵袭的变化

转染后各组细胞的迁移结果单因素方差分析显示，5组的迁移能力差异有统计学意义(F=12.57，P<0.05)。两两比较显示，与阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞迁移能力都显著减弱(P均<0.05)；siErbB2+IGF-1组迁移能力明显上升(P<0.05)。转染后各组细胞的侵袭结果单因素方差分析显示，5组的侵袭能力差异有统计学意义(F=15.67，P<0.05)。两两比较显示，与空白对照组相比，siErbB2组和wortmannin组细胞侵袭能力明显降低(P均<0.05)；siErbB2+IGF-1组侵袭能力明显上升(P<0.05)。见图4。

①细胞迁移检测；②细胞侵袭检测。A：空白对照组；B：阴性对照组；C：siErbB2组；D：wortmannin组；E：siErbB2+IGF-1组。与空白对照组相比，*P<0.05；与siErbB2组相比，#P<0.05。

3 讨 论

卵巢癌发病率位居女性生殖系统癌症第三，但其病死率却位居之首[9-12]。其发病隐匿，化疗等综合治疗效果不显著[13-17]。因此，提高卵巢癌早期诊断水平并探究其分子机制，对于提高卵巢癌病人生存率至关重要。而RNA干扰自其发现以来，便成为基因研究领域的热点[18-21]。基因沉默技术高效、方便，且具有极高特异性。ErbB2(HER2)基因在人类多种恶性肿瘤中呈高表达，且伴随恶性程度更高的细胞表型，诱发癌细胞增殖和转移[22-25]。既往研究者推测ErbB2在肿瘤细胞中的过度表达，与相关信号转导途径的异常相关，可诱导肿瘤微环境中良好的细胞生长环境[26]。也有学者报道，PI3K和Akt可以干扰细胞中ErbB2转录，进而影响该因子的致癌性[14]。因此，本研究作出如下假设：ErbB2基因沉默可能通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响。

本研究采用人卵巢癌细胞系HO8910细胞，进行分组培养及转染，设置空白对照组和阴性对照组，以siErbB2组表示抑制ErbB2表达，以wortmannin组表示对PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制，并进一步构建siErbB2+IGF-1组验证假设推理。采用qRT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。同时，应用MTT法、流式细胞术、Transwell侵袭实验和划痕实验检测各组细胞增殖、凋亡、迁移能力和侵袭能力的变化。本文研究结果显示，siErbB2组和siErbB2+IGF-1组ErbB2表达明显下降，而wortmannin组无明显变化，说明RNA干扰可作为研究ErbB2在卵巢癌中作用的有效工具。

为进一步了解ErbB2对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制。本研究后续实验应用ErbB2基因沉默技术和通路抑制剂wortmannin处理卵巢癌细胞，检测结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量则显著下降，Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加；而且与siErbB2组和wortmannin组相比，siErbB2+IGF-1组Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升。我们推测采用wortmannin抑制剂后，PI3K/Akt/eNOS信号通路效应分子PI3K、Akt、eNOS活化状态被抑制，进而抑制肿瘤细胞生长并促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的低氧耐受和肿瘤微环境中的生存能力。

本文研究结果还表明，siErbB2组、wortmannin组和siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降，而细胞凋亡率上升。与siErbB2组和wortmannin组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均上升，而细胞凋亡率下降。以上结果从PI3K/Akt/eNOS信号通路和细胞生物学特性两个方面证实，ErbB2基因沉默或许可通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，进而抑制细胞增殖并能促进细胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可发挥逆转作用。提示ErbB2在卵巢癌的生长转移的调控中可能发挥重要作用，且其分子机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

PI3K/Akt/eNOS信号通路在细胞增殖、凋亡中的作用，既往有众多报道。例如，LI等[27]报道，FGF21抑制剂可通过eNOS/PI3K/Akt信号通路抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移；AHSAN等[28]的结果显示，磷酸肌酸可通过调节PI3K/Akt/eNOS通路保护内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白诱导的凋亡的影响。目前针对ErbB2基因沉默通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响的研究较少，本文借助RNA干扰技术，从基因和蛋白水平证实ErbB2基因沉默可有效影响人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖、凋亡等生物学行为，提示ErbB2与卵巢癌细胞的生物学行为密切相关，且其可能机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制有关。

综上所述，本文的研究结果显示，ErbB2在卵巢癌细胞中呈高表达，RNA干扰技术可有效抑制ErbB2表达；ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，从而抑制卵巢癌细胞增殖、促进其凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可逆转ErbB2基因沉默作用，促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。本研究结果为临床卵巢癌的基因治疗提供了潜在依据。值得注意的是，本研究以细胞实验探究ErbB2在卵巢癌中的作用及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的分子机制，有待进一步动物实验和临床验证。同时，抑制ErbB2在卵巢癌中的表达进而发挥抑癌作用是否受到其他信号通路的影响，均为本研究未来探讨的方向。