干血点采样设备及方法在兴奋剂检查中的应用

2021-03-03温洪涛高久翔王新宅

体育科学 2021年11期

温洪涛，高久翔，王新宅，于亮*

（1.中国反兴奋剂中心，北京 100029；2.北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084）

干血点（dried blood spot，DBS）采样法作为采集生物样品的一种新型医疗血样处理方式，通过将极少量血样保存在滤纸上，干燥后用于疾病筛查和检测研究，具有创伤小、取样简单、运输方便、节省研究经费、可长期稳定保存样本等优势（Li et al.，2010；Matthew et al.，2018），受到各国多领域的重点关注。目前DBS检测方法已广泛应用在新生儿筛查、特异性抗体检测等领域（Mcdade et al.，2020；Thevis et al.，2020）。中国反兴奋剂中心（CHINADA）与国际奥委会（IOC）、世界反兴奋剂机构（WADA）、国际检查机构（ITA）和美国反兴奋剂机构（USADA）共同创立国际干血点项目，力争在北京冬奥会和冬残奥会正式实施，干血点项目成为我国首次在反兴奋剂领域全方位参与的创新项目。为确定并推广兴奋剂检查过程中最合适的DBS样本采集器材，中国反兴奋剂中心对不同项目运动员进行不同采血位置（指尖/上臂）的器材测试，通过确定符合“WADA干血点样本采集技术文件-TD2021DBS”（WADA，2021）规定采血量的样本收集方式，同时对运动员和检查官对于不同采血位置的偏好和器材的使用感受进行分析，旨在将DBS检查方法在反兴奋剂领域进行推广，做到从“抽检”到“普查”，从“等候检查”到“立行立检”。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

考虑到运动员性别、地区、从事项目、对手指依赖程度等因素，结合现有测试器材，本次测试工作选择来自12个项目，包含力量类、耐力类、技巧类等项群，覆盖奥运会和冬奥会的大部分兴奋剂高危项目，其中男运动员30名（18岁以下14人），年龄（17.43±3.65）岁，女运动员30名（18岁以下14人），年龄（17.47±4.01）岁。所有被试在进行任何研究程序之前均已签署知情同意书，基本情况见表1。

表1 测试对象基本情况Table 1 Basic Information of Subjects

手指依赖度要求较高的项目包括滑雪、击剑、举重、排球、皮划艇、拳击、赛艇和体操，手指依赖度要求较低的项目包括滑冰、自行车、游泳、田径（非投掷项目）。测试时间集中在10～11月，根据海拔、比赛温度、运动基地分布等因素将测试地区选在北京、黑龙江、贵州、青海、浙江。

1.2 研究方法

1.2.1 检查官选择

由于国际上尚未正式开展DBS检查，为统一工作标准，中国反兴奋剂中心通过内部小范围器材测试，结合国家卫生健康委发布的《WS/T 661—2020静脉血液标本采集指南》，制定“干血点样本采集程序”文件，并于开展测试前对中国反兴奋剂中心检察官进行实操培训，最终选取12名具有血液采集资质的专职检察官进行了11次采集测试。

1.2.2 采样器材选择

根据WADA技术文件中对100 μL血量的采集要求，选取 Tasso、HemaXis、HemaSpot、Capitainer及金豪 5种采血器材（Tasso设备自带内置针头，无对应的采血耗材），以及施莱低血量（SL）、施莱中血量（SM）、施莱高血量（SH）、BD低血量（BDL）、BD中血量（BDM）、BD高血量（BDH）6种采血针头，测试不同型号采血针头的最大采血量。5种采血器材的部分参数如表2所示。

表2 5种采血器材参数对比Table 2 The Parameters of 5 Blood Collection Equipments

1.2.3 采集程序及要求

由于干血点检查为新型检查方式，且有穿刺行为，因此，检查官采集过程中全程佩戴手套，并且保证运动员已洗手，手部清洁。检查官根据“干血点样本采集程序”，使用指定的采血针头及储存器材进行操作，采集过程包括采血、取样、保存、运输、分析等（图1）。

图1 干血点采样流程（以HemaXis DB10为例）Figure 1. Sample Collection Process of Dried Blood Spots（HemaXis DB10）

1）运动员在检查官的指示下，从3套干血点采血套件中选择1套，与检查官共同确认采血套件的完整性及安全性；2）运动员和检查官共同核对A/B采集卡、A/B采集卡密封袋以及外包装号码，确保所有号码一致；3）建议运动员暖化采样位置，例如，用温水洗手、甩手、按摩双手或采用外部加热等方式；4）选择运动员非优势手的无名指进行干血点样本采集，穿刺部位应尽可能无胼胝（老茧）和伤疤；5）用干燥的无菌纱布将第1滴血擦干，采集完成后在穿刺位置放置无菌止血棉，指导运动员持续按压30～60 s；6）运动员在检查官的指导下，将采集卡放入密封袋并确保密封袋内有干燥剂，运动员与检查官需共同确认密封袋密封性完好，将密封袋放入外包装袋中，再次确认外包装袋密封性完好；7）注意：为尽量减少皮下出血，建议运动员在至少30 min内不从事任何剧烈运动。

为测试采血器材在实际操作中的使用性和每种型号针头的最大采血量，每名运动员测试3种样本采集器材，除Tasso品牌采血设备外，其余器材分别选择同一品牌的不同型号针头，既测试器材，又同时测试针头出血量。采血过程中记录血量合格时手指的按摩次数。

1.2.4 使用体验调查

样本采集完成后，运动员和检查官均需填写体验问卷。体验问卷包括运动员体验和检查官测试体验2部分，对每次测试进行记录。运动员体验问卷主要收集运动员基础信息、兴奋剂检查经历、采血针头痛感体验、器材采集过程体验、兴奋剂检查类型偏好和意见等方面。检查官测试体验主要记录采血量、按摩手指次数、器材使用体验、样本采集时间、样本采集满意度以及意见建议等。

1.3 统计方法

使用IBM SPSS Statistics 22.0对数据进行统计分析，结果以平均值±标准差（M±SD）表示，差异显著性水平P＜0.05，借助GraphPad Prism 6.0软件作图。

2 实验结果

2.1 采集类型偏好

在样本采集完成后，对60名被试运动员进行样本采集偏好调查。7人因之前未参加过兴奋剂检测故不做统计，53名运动员共收集159人次采集偏好结果，其中110人次将DBS采样方式排在第1顺位，99人次将血检采样方式排在第2顺位，93人次将尿检检查方式排在第3顺位。对运动员偏好进行量化分数统计，第1顺位得3分，第2顺位得2分，第3顺位得1分。统计结果显示，DBS平均得分为2.54±0.74，尿检平均得分为1.61±0.79，血检平均得分为1.85±0.60，运动员对这3种检查方式的偏好具有显著性差异（图2）。

图2 运动员对兴奋剂检查方式的偏好Figure 2.Athletes’Preference for Doping Control Methods

2.2 痛感及满意度

为排除不同手指痛感反应程度不同的影响，本研究统一对受试者非优势手的无名指进行采样，通过李克特量表量化运动员采血过程中的痛感程度（总分10）。大多数运动员认为，DBS采集过程中的痛感在2～4之间，有5次采集评分≥8分。分析运动员对不同采血器材及针头的痛感，结果显示（图3），Tasso采集手臂血痛感评分为2.82±2.10。指尖血采集中，施莱品牌SL针头痛感评分为2.77±1.76，SM针头痛感评分为3.00±1.41，SH针头痛感评分为2.75±1.73。BD品牌BDL针头痛感评分为2.29±1.35，BDM针头痛感评分为2.00±1.24，BDH针头痛感评分为3.55±2.43。统计发现，运动员对各针头的疼痛感无显著性差异。

图3 运动员对不同采血针头的痛感评分Figure 3.Athletes’Pain Scores for Different Blood Collection Needles

通过对受试运动员采血针头痛感与满意度情况调查发现（表3），运动员对各采血针痛感评价符合预期率达到77.42%。对SL、SM、SH、BDL、BDM采血针的满意率为100%。手臂采集及高血量针头采集指尖血的刺痛感较强，但中国运动员经常接受生化测试，对痛感反馈一般。

表3 采血针头痛感与满意度情况统计Table 3 The Pain Feeling and Satisfaction of Blood Sampling Needles

2.3 采血量情况

将不同种类针头采血量同WADA规定的100 μL定量采集要求相比发现（表4），与BDL针头采血合格率相比，其余6组采血合格率均具有统计学差异（χ2=45.528，P＜0.05），但该6种针头之间采样合格情况无统计差异（P＞0.05）。

表4 不同针头采血合格情况统计Table 4 The Qualifications of Different Blood Sampling Needles

进一步对采血量进行分析（图4），SL针头平均采集指尖血（171.77±83.01）μL，SM针头平均采集指尖血（135.00±64.68）μL，SH针头平均采集指尖血（167.50±87.88）μL，表明施莱品牌3种采血针的采血量并无显著差异，均可满足要求。BDL针头平均采集指尖血（53.81±39.05）μL，无法满足要求，采血量显著低于BDM和BDH两种型号，BDM针头平均采集指尖血（164.81±93.49）μL，BDH针头平均采集指尖血（220.00±101.73）μL。Tasso采集手臂血平均采血（89.85±29.45）μL。

图4 不同采血针采血量统计Figure 4.The Blood Collection Volume of Different Needles

手臂血的采血量普遍低于指尖血，合格率也相对较低。指尖血收集过程中BDL针头出血量集中在0～49 μL，无法满足WADA要求的100 μL定量采集，其余5种针头出血量虽会出现100 μL以下的情况，但发生率较低，并且平均出血量可满足WADA要求（图5），并且5种针头出血量之间无显著性差异。在满足WADA采样量要求的基础上，从运动员权益角度考虑，可使用出血量较少的SM型号采血针，从检查官采样合格率角度考虑，可使用BD品牌的BDM和BDH型号的采血针。

图5 不同针头出血量分布情况Figure 5.Distribution of Blood Collection Volume of Different Needles

2.4 采血时间

本研究采血时间从拆除包装取出采血针开始记录，到将血液收集到过滤卡中截止。统计发现，DBS采血平均用时（3.81±2.41）s，Tasso采集手臂血平均用时（7.90±2.19）s，手臂血采集时间显著高于指尖血采集时间（P＜0.01）。SL针头采集指尖血用时（2.58±0.89）s，SM针头采集指尖血用时（3.50±1.18）s，SH 针头采集指尖血用时（2.91±0.94）s；BDL针头采集指尖血用时（3.10±1.04）s，BDM针头采集指尖血用时（2.68±1.18）s，BDH针头采集指尖血用时（2.79±1.29）s（图6）。整体比较，指尖血采集较为方便，不同型号针头采集指尖血的时间无明显差异。

图6 不同采血针采血时间比较Figure 6.The Blood Collection Time of Different Needles

2.5 采血按摩次数

为满足采血量要求，取血时向远端方向轻轻按摩手指近端以增加血流量（WADA，2021）。Tasso采集手臂血时，一般一次性就可以完成采集。使用不同针头采集指尖血发现，施莱的SL，SM，SH采血针分别需要按摩（7.16±2.11）次、（8.10±1.74）次、（7.09±2.00）次手指，方可满足采血量要求。BDH采血针需要按摩手指次数最少，只需（4.83±2.65）次即可满足采血量的要求，其按摩手指次数显著少于其他采血针。BDL采血针需按摩（8.21±1.45）次。BDM采血针需按摩手指（6.22±2.58）次，明显少于SH和SM采血针按摩手指的次数（图7）。从按摩次数考虑，BDM、BDH采血针更理想。

图7 不同采血针采血按摩手指次数Figure 7.Finger Massage during Blood Collection of Different Blood Collection Needles

2.6 问题分析

使用5种采血器材对手臂和指尖进行采血180次，失败51次，总失败率为28.3%。其中使用Tasso对运动员进行手臂采血34次，失败12次，失败率26.5%。使用HemaXis采集指尖血37次，失败7次，失败率18.9%。使用HemaS-port采集指尖血38次，失败6次，失败率15.8%。使用Capitainer采集指尖血34次，失败13次，失败率38.2%。使用金豪采集指尖血37次，失败8次，失败率21.6%。比较发现，HemaSport采集成功率最高，明显高于Capitainer采集成功率（P=0.027）。

进一步分析失败原因发现，运动员凝血过快、针头采血量不足是采血失败的重要原因，运动员自身血脂过高也会对采血过程造成一定影响。使用Tasso采集手臂血失败12次，1次因运动员血脂过高，11次因采集血量不足。

使用HemaXis采血器材失败7次，出现1次血脂过高、1次凝血过快和5次采血量不足情况，其中SH采血针出现2次血量不足，BDL采血针出现3次血量不足情况（图8）。

图8 HemaXis器材与不同采血针使用情况分析Figure 8.The Use of HemaXis Devices with Different Blood Collection Needles

使用HemaSpot采血器材失败6次，出现1次凝血过快和5次采血量不足情况，其中BDL采血针出现4次血量不足，BDM采血针出现1次凝血情况（图9）。

图9 HemaSpot器材与不同采血针使用情况分析Figure 9.The Use of HemaSpot Devices with Different Blood Collection Needles

使用Capitainer采血器材失败13次，出现3次凝血过快和10次采血量不足情况，其中SL、SM、SH采血针各出现2次血量不足情况，BDL采血针出现1次血量不足，BDM采血针出现2次血量不足，BDH采血针出现1次血量不足情况（图10）。

图10 Capitainer器材与不同采血针使用情况分析Figure 10.The Use of Capitainer Devices with Different Blood Collection Needles

使用金豪品牌采血器材失败8次，出现1次血凝过快和7次采血量不足情况，其中SL采血针血量不足3次，SM采血针血量不足1次，BDL采血针血量不足2次，BDH采血针血量不足1次（图11）。总体来看，金豪品牌采血设备搭配不同采血针均有失败可能。

图11 金豪器材与不同采血针使用情况分析Figure 11.The Use of Jinhao Devices with Different Blood Collection Needles

综上，不推荐Capitainer采血器材，金豪采血器材与SM或BDM采血针搭配使用次数较少，同时与其他型号采血针搭配均有失败可能。BDM和BDH采血针可与除Capitainer外的采血器材一起使用。建议综合考虑不同采血器材与采血针搭配情况，HemaXis采血器材可搭配BDM或BDH采血针使用，HemaSpot采血器材可搭配SL、SM、SH、BDM、BDH采血针一起使用。

3 讨论

面对即将到来的2022年北京冬奥会，WADA与世界各地的反兴奋剂机构积极推进DBS技术的开展和实施（WADA，2019）。新冠肺炎疫情期间，美国反兴奋剂机构通过尝试新研发的Tasso干血点采集设备，以远程视频监督的方式对运动员进行DBS试验，以解决各地体育赛事停摆及人员流动限制造成的传统兴奋剂采样工作无法开展的问题（新华社，2020）。随着北京冬奥会的临近，兴奋剂检查的需求大幅提升，相比传统的尿检和血液检查，推广更简洁有效的采样流程是提高兴奋剂检查效率、确保运动员纯洁参赛的重要途径。本研究通过对不同采血器械及采血针采血效果、运动员和检查官的偏好反馈进行比较，确定最佳的采血组合器械以便在后续兴奋剂采集过程中进行推广应用。

3.1 对DBS检查的反馈评价

目前DBS样本采集有两种方式，一是对指尖或上臂进行穿刺，采集60～100 μL血液直接制成干血点，二是采集静脉全血样运输至实验室后，再制成干血点。考虑到采集效果和运动员体验，本研究选择第1种DBS采集方式。对运动员进行调查研究发现，运动员整体认为疼痛感较低，对DBS采集满意度较高。有研究报道，在身体表面多个区域进行痛感灵敏度测试时，指尖是对疼痛最敏感的区域（Mancini et al.，2014），但在本研究中，运动员对BDM针头采集指尖血的痛感最低，并且各种针头采血疼痛感无明显差异，手臂和手指间痛感无差异，可能与测试样本数量较少，标准差较大有关，也可能与60名受试运动员中有29人未满18岁，收样时需教练陪同，无法真实反馈痛感有关。运动员对采血位置的偏好，暂未发现与性别、运动项目、区域等因素有关，对于选择指尖血的运动员来说，仅仅是因为手部血液流动性相对较好，采集只需要几秒钟，操作方便。此外，相比传统的尿液和静脉血采集，美国反兴奋剂机构调查14名运动员发现，其中13人认为DBS样本采集器材容易操作，德国反兴奋剂机构对65名运动员进行的一项研究中，81%的人对Tasso-M20器材的总体评价是“非常好”，86%的人对其评价“使用简单”（Fedoruk，2020a），本研究中运动员也更倾向在未来兴奋剂检查时使用DBS技术，因为DBS采集过程简单、快速、不令人生畏。另外，本研究只涉及12名检查官参与，后续可扩大检察官调查范围，从运动员和检查官角度分别对DBS技术的应用效果进行评价。

3.2 DBS采血过程分析

目前兴奋剂检测的全血、血清和尿液样本均要在严格控制的条件下进行采样、收集、转移，并在WADA认证的反兴奋剂实验室完成检测，以上过程需考虑样本采集时间、成本、方式、污染和稳定性等问题。DBS技术可较好地解决上述问题，通常大部分DBS检查可在5 min内完成，本研究取血过程集中在2～12 s，并且不受采样时间、地点和人员等因素限制，为非专业人士自我取样或大规模样本采集提供了可能（Sikombe et al.，2019）。与传统尿液检查相比，DBS采样过程无需提供尿液样本，排除了尿液被污染、伪造的可能（Fedoruk et al.，2020b）。与传统静脉取血相比，DBS技术具有创伤小、取量少、降低接触感染率等优势，此外，DBS采样不受严格温度限制，运输方便并可以保证样本的稳定性。

目前已开发出几种DBS采样设备，如HemaXis™、hemaPEN™采血装置和VAMS™采血技术，在无需点样的条件下直接采集指尖血形成DBS。本研究根据目前国内器材现有情况，通过筛选5种采血设备和6种采样针头进行组合比较，以便确定最佳DBS取样组合，为后续推广DBS采样技术做准备。TASSO上臂血采集装置虽然能通过完全集成的设备实现更加一致、安全和快速地形成4个20 μL DBS样本（Fedoruk et al.，2020b），但无法满足WADA定量采集100 μL血液的要求。指尖血采集时，BDL采血针无法取血100 μL，但BD品牌的中、高血量针头取血合格率高于施莱品牌的3种针头。在与5种采血装置配合使用过程中发现，Capitainer装置失败率最高，13次失败中10次因采血量不足，但仅3次与BDL针头搭配所致，进一步分析原因，推测可能与该器材对血液样本质量、点样温度的要求高，同时血液自身黏度导致血液在滤纸上扩散程度不同，引起血细胞比容效应依赖性偏差等（Lange et al.，2020）。HemaXis、HemaSpot、金豪 3 种装置中 HemaSpot失败率最低。故后续使用DBS技术进行兴奋剂采样时，暂推荐指尖血采集，以BD品牌中、高血量采血针为主，优先考虑与HemaSpot装置一起使用，不推荐使用Capitainer装置。

3.3 DBS失败情况分析

传统静脉血采集是将医疗器械介入到人体内，对血管进行直接干预和操作，对运动员造成一定伤害，操作人员的规范性将直接影响采集血液的质量及实验室生化检测结果。国外因实验室前操作不当引起的血液标本不合格率为 46%～68%（Lippi et al.，2013），国内为 35%～75%（容桂荣等，2008）。2010年WHO报告最常见的3种不合格血液标本类型为溶血、污染和标签错误（World Health Organization，2010），我国不合格血液标本类型主要为溶血、标本凝块和血液标本量不合格（高立卉等，2015）。DBS采样操作简便，能有效降低因操作不当引起样本不合格的风险。本研究中180次DBS采样的失败率为28.3%，失败情况集中在采血量不足和血液凝固两方面，低于传统静脉取血的不合格率，其中采集指尖血失败率为25%（26次血量不足、8次凝血或血脂高），与前期丹麦反兴奋剂机构调查报告中28%失败率接近，但本研究在统计采血失败率时仅为样本采集阶段，在实验室检测阶段的情况并未考虑，后续随着研究的推进，可结合采样和检测阶段的结果综合考察不同品牌、型号采血器材的搭配使用情况。通常在指尖血采血过程中为保证获得足够的血量，在对手指进行轻微按摩时经常伴有“挤”手指的被动情况，这可能是由于未对手指进行预热，手指末梢血液循环不畅，血液在血点HF滤纸上凝结或在手指上凝结，导致采集的血液量不足，提示在针头采集血液后可通过移液枪将血液转移到采样卡（Loria et al.，2020），同时注意保证吸血装置距离采样卡若干毫米，以便血样碰触到卡时会迅速均匀分散开（Edelbroek et al.，2009）。美国等国家逐渐推广的Tasso装置在本研究中采集手臂血的失败率为35.3%（11次血量不足、1次血脂高），远高于丹麦反兴奋剂机构调查报告中的6%。因运动项目对手指依赖度的需求及运动员个人喜好不同等原因，应排除器材自身结构、故障、操作等因素，后续进一步具体分析血量不足的原因，降低失败率并进行应用推广。