刘心悦 崔洁 贺超 王文全

摘要 目的：探讨补中益气丸发挥抗疲劳作用的主要活性成分和潜在的机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选补中益气丸中的活性成分，利用Swiss Target Prediction、Drugbank、Cytoscape 3.7.1、R语言等数据库及软件预测活性成分作用靶点和“疲劳”相关靶点、构建疾病-药物-有效成分-靶基因的互作网络和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行关键靶基因的基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，最后通过设计动物实验探究补中益气丸的抗疲劳药效。结果：分析表明与补中益气丸抗疲劳相关的163个潜在活性成分作用于与疲劳相关的108个靶点和160条通路。进一步网络特征分析发现表现主要活性成分为黄酮类和甾醇类化合物，通过参与脂多糖应答、对原细菌分子的反应等生物过程，调控MAPK、PI3K-AKT、TNF等信号通路进而发挥抗疲劳作用。药效学试验结果提示补中益气丸可显著增强小鼠运动耐力，但无显著缓解体力疲劳的效果。结论：补中益气丸具有多成分-多靶点-多途径的抗疲劳特点，其活性成分作用于多个靶点蛋白，调控多个生物过程及信号通路，起到改善机体氧化应激反应，调控细胞功能等作用，但在调节机体能量代谢方面未有明顯的富集效果及药效学试验结果。本研究为进一步开发抗疲劳功能产品及药品和临床应用提供理论指导，为探究补中益气丸抗疲劳作用机制提供新思路。

关键词 补中益气丸;抗疲劳;网络药理学;作用机制

Mechanism of Anti-fatigue of Buzhong Yiqi Pills Based on Network Pharmacology

LIU Xinyue1，CUI Jie1，HE Chao1，WANG Wenquan 1，2，3

（1 Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China; 2 School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China; 3 Engineering Research Center of Good Agricultural Practice for Chinese Crude Drugs，Ministry of Education，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To explore the main active components and potential mechanism of Buzhong Yiqi Pills in anti-fatigue.Methods：The potential active components in Buzhong Yiqi Pills were screened according to TCMSP database.Swiss target Prediction，drugbank，Cytoscape 3.7.1，R language and other databases and softwares were used to predict the target of active ingredients and fatigue related targets，to construct the interaction network of disease-drug-active-ingredients target genes and PPI network of protein interaction，and to carry out enrichment analysis of GO and KEGG of key target genes.Finally，animal experiments were designed to explore the anti-fatigue effect of Buzhong Yiqi Pills.Results：The results showed that 163 potential active components related to Buzhong Yiqi Pills could act on 108 targets and 160 pathways related to fatigue.Further analysis of the network characteristics showed that the main active components were flavonoids and sterols，which regulated MAPK，PI3K AKT，TNF and other signaling pathways through participating in lipopolysaccharide response，the reaction of source bacterial molecules and other biological processes，thus playing an anti-fatigue role.The results of pharmacodynamics test showed that Buzhong Yiqi Pills could significantly enhance the exercise endurance of mice，but had no significant effect on relieving physical fatigue.Conclusion：Buzhong Yiqi Pills gets the anti-fatigue characteristics of multi-component，multi-target and multi-channel.Its active components can regulate multiple biological processes and signal pathways by interacting with multiple target proteins，which can improve the body′s oxidative stress response and regulate cell function.However，it has no obvious enrichment effect and pharmacodynamic results in regulating the body′s energy metabolism.This study provides theoretical guidance for the further development of anti-fatigue functional products and drugs and clinical application，and provides new ideas for exploring the anti-fatigue mechanism of Buzhong Yiqi Pills.

Keywords Buzhong Yiqi Pills; Anti-fatigue; Network pharmacology; Mechanism of action

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.008

疲劳是一种涉及多重复杂因素的主观意识，按照属性可分为生理性疲劳和病理性疲劳，前者通常发生在强烈的体力劳动之后，往往是一个机体自我保护信号，建议身体休息。而后者症状不会随着休息而缓解，如癌因性疲劳、免疫系统介导的病毒感染性疲劳、慢性和精神疾病如多发性硬化症、肺结核、帕金森病、艾滋病、脑卒中、慢性阻塞性肺疾病和精神分裂症等伴随的疲劳[1-6]。病理性疲劳感更强烈，持续时间更长，会对个体的功能活动和生命质量造成严重损害。研究表明，疲劳的发生机制主要涉及能量代谢，氧化应激、代谢产物累积、免疫系统紊乱、内分泌系统失调等[7]。

补中益气丸出自《脾胃论》，为益气健脾的代表方剂，由黄芪（蜜炙）、党参、甘草（蜜炙）、白术（炒）、当归、升麻、柴胡、陈皮组成，具有补中益气，升阳举陷的功效[8]。中医认为气为人生命活动的根本，李东垣在《脾胃论·脾胃虚实传变论》中言道“元气之充足，皆由脾胃之气无所伤，而后能滋养元气”，脾胃的作用为运化水谷精微，布输全身，维持正常的生命活动。现代药理学研究表明补中益气丸具有促进胃肠蠕动、抗炎、抗肿瘤等药理作用[9-12]。补中益气丸的抗疲劳效果也已被初步证实，研究发现补中益气丸可有效缓解癌因性疲劳（Cancer-related Fatigue，CRF）[13-14]，并且能改善急性运动后大鼠脑组织呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ及ATP酶活性，对线粒体氧化磷酸化有一定的保护作用，可显著降低运动后大鼠血清丙二醛（MDA）含量，提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，从而提高机体抗疲劳能力[15-17]，杨可文等[18]观察到大剂量补中益气汤治疗运动疲劳的临床有效率为96.87%，且无不良反应。

网络药理学从整体和系统的角度探索药物与疾病的关系，这与中医的整体特征非常一致[19]，以系统生物学和多重药理学理论为基础，利用网络可视化和网络分析技术揭示药物、有效成分、靶点和疾病之间复杂的生物网络关系，以期预测药理作用机制[20]。关于补中益气丸抗疲劳机制系统、深入的研究尚未见报道，因此本研究拟通过网络药理学的方法，阐释其潜在作用机制，为相关功能产品及药品的开发和临床应用提供理论参考，为探究其抗疲劳作用机制提供新思路，本研究方法路线图。见图1。

1 资料与方法

1.1 药物有效活性成分及对应靶基因的获取

采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索，根据ADME参数设置口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为过滤标准，分别搜集补中益气丸中8种中药的主要活性成分。利用Swiss Target Prediction数据库筛选出活性成分对应靶标;并利用UniProt數据库（https：//www.uniprot.org/）将靶标名称进行统一注释，获得有效成分靶基因集，该数据库可集中、准确捕获基因资源信息。

1.2 疾病（疲劳）靶基因集的建立

在DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）以及DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）中以“fatigue”“anti-fatigue”为关键词进行检索，查找与疲劳有关的靶标并进行整合去重，获得疲劳靶基因集。

1.3 疾病-药物-活性成分-靶点网络的构建

利用TBTools得到补中益气丸有效成分靶基因集与疲劳靶基因集的交集靶点并制作韦恩图，将共有基因作为候选预测靶标，创建“药物-成分-靶点”及“疾病-靶点”关系文件及属性文件，导入Cytoscape 3.7.1软件中进行可视化操作，形成疾病-药物-药物成分-靶点的作用网络，并对数据进行拓扑分析。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将“补中益气丸”与“疲劳”的共同作用靶点导入STRING数据库（https：//string-bd.org/）中，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，隐藏网络中无联系的节点，其余参数不变，并根据蛋白之间的关联度进行排序。获取靶点相互作用的网络关系数据，将其导入Cytoscape 3.7.1软件，绘制PPI网络图。

1.5 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

在R语言4.0.2程序中安装“Bioconductor”软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将药物-疾病共同靶点转换成Entrez Gene ID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的Entrez Gene ID，以P<0.05，Q<0.05进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析，按照显著性大小进行排序，选取前20条通路绘制气泡图。

1.6 补中益气丸抗疲劳药效学评价

本研究在北京协和医学院药用植物研究所实验动物中心SPF级环境下饲养8周龄SPF级BABL/C雄性小鼠，体质量为（20.0±2.0）g，共计24只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），使其自由进水进食，适应性喂养一周后分为2组，每组12只，空白组每天灌胃蒸馏水，补中益气丸组将补中益气丸（国药准字Z36021765）进行超声溶解于蒸馏水后再进行灌胃，灌胃量为10 mL/（kg·d）。30 d后小鼠进行负重力竭游泳试验：将尾部负重5%体质量铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳，记录小鼠自游泳开始至力竭而沉入水中并维持8 s不能浮出水面的时间，并马上把小鼠捞出水面[21]。而后继续灌胃3 d，进行血清尿素氮（BUN）测定：末次给受试样品30 min后，不负重游泳90 min，休息60 min后进行眼眶采血，取血清备用，利用全自动生化仪（贝克曼库尔特au480）及血清尿素氮试剂盒（购自中生北控生物科技股份有限公司，批号190971）进行BUN含量检测[22]。在灌胃38 d时，颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏制备肝组织匀浆，按照肝糖原酶联免疫试剂盒（购自上海酶联生物科技公司）说明书测定肝糖原含量。

本研究由北京协和医学院药用植物研究所实验动物中心伦理委员会批准通过（伦理审查号：SLXD-20190826005）。

1.7 数据分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，符合正态分布的数据以均数±标准差（±s）表示，方差齐性则2组间比较采用独立样本t检验，置信区间设置为95%，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物有效活性成分及对应靶基因的获取

补中益气丸所涉及的八味中药中黄芪（包括20种化合物）、党参（包括21种化合物）、甘草（包括92种化合物）、白术（包括7种化合物）、当归（包括2种化合物）、升麻（包括17种化合物）、柴胡（包括17种化合物）、陈皮（包括5种化合物）的有效成分在整合并去重后共计163种，其中部分有效成分的信息见表1。

2.2 疾病-药物-活性成分-靶基因网络图

为了研究补中益气丸对疲劳的调控作用，需要对其中涉及的活性成分进行疲劳-多成分-多基因分析。首先通过Drugbank、GeneCards、DisGeNET数据库以“Fatigue”“Anti-Fatigue”为关键词进行检索，获得与疲劳相关的作用靶点1 226个。通过韦恩图获取补中益气丸活性成分与疲劳交集基因108个。见图2。将“疲劳”、补中益气丸中的8味中药及其活性成分、核心靶标录入Cytoscape 3.7.1软件中，构建疲劳-药物-活性成分-靶基因PPI网络图。见图3。网络图包含节点235个，边线1 110条。见图3。

依据软件中导出的default node.csv文件，发现与抗疲劳相关的163种活性成分中，度值排名前10位的活性成分具体信息及拓扑性质见表2，其化学结构见图4。将交集靶标录入STRING数据库，获取蛋白相互作用关系并导出tsv文件。探索蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions）和相互作用网络对于理解细胞组织、生物过程和功能非常重要，蛋白质常通过PPI执行特定的生物功能[23]。利用Cytoscape 3.7.1软件构建出蛋白互作PPI网络图（图5），其中排名10位的关键靶点（degree>20）拓扑信息见表3。

2.3 GO和KEGG的富集结果

通过GO功能富集分析，补中益气丸八味中药中与抗疲劳相关的潜在关键靶点基因共涉及生物过程（Biological Process，BP）富集条目2 109个，排名前5条的是脂多糖应答（Response to Lipopolysaccharide，34个基因）、对源细菌分子的反应（Response to Molecule of Bacterial Origin，34个基因）、抗生素响应（Response to Antibiotic，31个基因）、化学应激反应（Cellular Response to Chemical Stress，29个基因）和活性氧代谢过程（Reactive Oxygen Species Metabolic Process，27个基因），得到细胞组分（Cell Component，CC）条目59个，前三条是膜筏（Membrane Raft，22个基因）、膜微区（Membrane Microdomain，22个基因）、膜区（Membrane Region，22个基因），得到分子功能（Molecular Function，MF）条目137个（P<0.05），主要富集在細胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding，17个基因）、细胞因子活性（Cytokine Activity，15个基因）、磷酸酶结合（Phosphatase Binding，14个基因）、蛋白磷酸酶结合（Protein Phosphatase Binding，12个基因）等。取各类别排名前20的GO条目绘制气泡图见图6。

KEGG通路富集得到160条（P<0.05），主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎、卡波济氏肉瘤疱疹病毒感染、TNF信号通路等通路、内分泌抵抗、MAPK、PI3K-AKT、AMPK信号通路等。见图6。说明补中益气丸主要活性成分的作用靶点分布在不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节。表4为部分通路的网络特征，图6为GO功能和KEGG途径富集分析前20位结果：y轴显示靶基因的GO和KEGG途径显著富集，x轴显示基因比率。基因比率表示属于GO或KEGG途径的靶基因数量与所有注释基因数量的比例。基因比例越高，富集程度越高。粒径越大，GO或KEGG途径中靶基因的数量越多，红点越深，P值越小，代表与补中益气丸干预疲劳关系越密切。

2.4 动物试验结果

与空白组比较，补中益气丸组的小鼠力竭游泳时间显著延长，延长率为30.63%，肝糖原含量增加了4.7%，血清尿素氮含量没有降低，后2个指标均无显著性差异，提示补中益气丸可显著增强小鼠运动耐力，但对于调节机体能量代谢方面无明显作用，分析可能原因是给药剂量过小。见表5。

3 讨论

氧化应激是疲劳的产生机制之一，氧化应激是指活性氧（ROS）的产生与机体抗氧化防御系统能力之间的不平衡，ROS是造成肌肉疲劳的主要原因。而排名前10位的核心有效成分中有9种都是黄酮类物质，黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，不仅能清除ROS或减少ROS形成，还可通过调节免疫系统提高机体耐受能力，减缓肌肉的损伤及能量的过度损耗，达到抗疲劳作用[24-25]。Lv等[26]发现甘草查尔酮A对对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤具有保护作用，这可能与Nrf2介导的抗氧化防御机制密切相关。在中度氧化损伤中，槲皮素可减少ROS的产生，并激活PI3K-AKT和ERK1/2信号通路促进神经元的成活[27]。此外，槲皮素还能引起双相、剂量依赖性效应，在低浓度下，起到抗氧化剂的作用，但在高浓度下作为一种促氧化剂发挥作用，可能会用于化疗[28]。研究表明激活PI3K-AKT信号通路可抑制活性氧诱导的细胞损伤[29]，作为重要的抗氧化通路，它是本KEGG富集结果中值得关注的通路之一。PI3K-AKT信号通路是由一系列酶联受体介导的信号转导通路，不仅参与多种生长因子、细胞因子和细胞外基质等信号的转导，同时还参与细胞凋亡、成活以及调控细胞糖代谢等多种细胞功能的调节[30-31]。另外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路亦在机体对环境应激适应及维持机体内氧化抗氧化动态平衡状态中发挥着重要的作用[32]。在度值排名前10位的核心靶点之中有4个属于MAPK家族，可见其调节机体疲劳的重要性。MAPK信号通路是由一系列连续作用的激酶组成，其中细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）是MAPK级联的主要组成部分，负责在细胞膜上传递生长因子信号，激活MEK1-ERK1/2可增强小鼠肌肉代谢效率、耗氧量及肌肉抗疲劳能力[33]。由此可见，上述两条通路可通过改善机体氧化应激而达到缓解体力疲劳的效果，这也与GO（BP）富集分析得到的补中益气丸调控氧化应激反应与活性氧代谢相一致。王蕾等[16]亦发现补中益气丸对线粒体氧化磷酸化过程有一定的保护作用，可明显升高小鼠急性运动后脑组织呼吸链复合体Ⅱ和Ⅳ活性，防止急性运动后脑组织Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的下降，保障呼吸电子传递链电子传递功能的正常。

在KEGG富集的前20条通路中，有4条为癌症通路：前列腺癌、胰腺癌、癌症中的蛋白多糖及MicroRNAs，可见疲劳是癌症发生发展及治疗干预过程中伴随的病理现象，CRF严重影响患者的生命质量[34-35]。有5条与病毒感染相关通路，而病毒感染亦与癌症有关，世界卫生组织将本次度值排名第一位的卡波济氏肉瘤疱疹病毒（KSHV）列入“一类致癌病毒”清单中。研究指出MAPK和PI3K-AKT信号通路与肿瘤有着千丝万缕的关系，它们的双重抑制在理论上是一种很有前途的抗癌方法，但其临床应用仍有待研究[36]。活性成分之一木犀草素通过调节活性氧诱导的P38MAPK/NF-κB通路和钙诱导的线粒体凋亡信号通路保护HO诱导的氧化应激：上调人内皮细胞eNOS表达，下调iNOS表达、线粒体膜bcl-2/bax比值及线粒体细胞色素C的释放，从而增强细胞抗凋亡能力，起到抗肿瘤作用[37]，进而减轻CRF症状。甘草查尔酮A在多种肿瘤细胞中表现出促凋亡自噬，抗细胞增殖的作用[38-39]从而具有一定抗癌作用。另有研究发现槲皮素与多种癌症相关途径相互作用，通过调节PI3K-AKT/mTOR通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK/ERK1/2通路，对癌细胞和肿瘤发挥抗癌作用[40]。Maurya等[41]用300 μmol/L槲皮素预处理可抑制H2O2诱导的ROS的增加，显著下调AKT、PDK1、BAD的磷酸化及肿瘤坏死因子TNFR1水平，并上调抑癌基因PTEN水平，结果提示槲皮素和PI3K抑制剂PI-103抑制PI3K-AKT途径以调控肿瘤细胞的作用机制相似。

在疲劳的生物学基础中，炎症介质可能发挥重要作用，疲劳是免疫介导的炎症和感染后经常观察到的一种临床症状，生物体对感染、疾病行为的适应性反应可最大限度地减少能量消耗，并通过炎症消退来改善能量代谢效率[42]。由分析结果可知，本研究中与炎症相关生物过程与通路的度值普遍偏高，例如脂多糖（LPS）應答及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，LPS是革兰阴性菌主要的致病物质，也是导致严重炎症感染的直接原因，其与机体免疫功能的密切关系，生命科学研究常常提取LPS进行诱导生长促进因子如白细胞介素的合成与分泌及动物炎症反应[43-44]。而“糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路”涉及TNF、CASP3、IL6、IL1B、STAT1等炎症介质，以肿瘤坏死因子TNF为例，其主要由活化的单核巨噬细胞产生，活化的TNF与细胞膜中的受体（TNFR1，TNFR2）结合，导致许多基因的激活，启动核因子κB通路和MAPK通路[45]，大量TNFα可参与诱导IL-1、IL-6、IL-8的表达，从而释放细胞因子和炎症介质，引起组织坏死。本次筛选到的活性成分山柰酚能降低HO和百草枯诱导的氧化应激和炎症反应，降低炎症标志物如核因子κB、TNF-α、IL-6的含量[46]，从而改善能量代谢，缓解体力疲劳。

提高及机体能量供给，改善能量代谢水平亦是缓解疲劳的重要机制之一，值得关注的相关通路如AMPK信号通路，AMPK激酶可感知细胞能量和营养水平，在机体中维持能量代谢的完整性和脂肪代谢的效率，是一种燃料传感器和调节器，在不同的组织中促进ATP的产生和抑制ATP的消耗，AMPK激酶通常被低ATP水平激活，可促进GLUT4的转录和转位，导致胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加[47-48]。药效学试验中测定的小鼠负重力竭游泳时间直接反映小鼠的运动耐力，运动耐力依赖于包括糖原的储存、脂肪的消耗和代谢产物的积累等因素;肝糖原作为重要的能源储备物质用于补充血糖的消耗，使得机体内的血糖保持长时间的稳定，推迟疲劳发生;血清尿素氮主要反映机体内蛋白质的代谢情况，机体在长时间运动后，体内能源储备糖原物质消耗，就会开始消耗体内蛋白质，从而产生大量尿素，机体对运动负荷的适应性越低，形成的尿素越多。以上3个指标皆反映机体能量代谢，试验结果表明补中益气丸可显著提高机体耐力，但不明显著改善机体能量代谢水平，可能是给药剂量过小的原因。

综上所述，补中益气丸具有多成分-多靶点-多途径的作用特点，通过改善机体氧化应激反应，调控细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能及减轻免疫介导的炎症和感染进而缓解疲劳，但是在调节机体能量代谢方面未有明显的富集效果，这与药效学试验结果相符，推测补中益气丸在缓解病理性疲劳方面效果更加显著。

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（2020-01-20收稿 责任编辑：魏庆双）