王 静，邹荣成，汪 捷，罗 兵

阿尔茨海默病又称老年痴呆，是一种常见的中枢神经系统变性病，严重影响病人的认知及生活能力，降低病人生活质量。老年痴呆发病原因复杂，发病机制尚未完全阐明，尚无可靠有效的治疗方案[1-3]。目前临床常采用盐酸多奈哌齐进行治疗，该药能够可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶引起的乙酰胆碱水解从而增加受体部位的乙酰胆碱含量，因此，短期内能够取得较好的治疗效果，但无法从根本上延缓或阻止疾病的发展，且存在一定的副反应[4-5]。脑脉通是由大黄、人参、葛根、川芎组成的复方中药，可有效改善脑缺血再灌注损伤，是治疗脑梗死的常用药物。临床研究发现盐酸多奈哌齐联合脑脉通治疗老年痴呆效果显著，疗效稳定，但关于两者联合用药治疗老年痴呆的作用机制尚未明确。老年痴呆病人脑组织常伴有一定的炎症反应，而炎症反应会导致病灶部位内皮糖萼损伤。内皮糖萼是覆盖在内皮细胞表面的一种多糖蛋白类复合物，其损伤将会导致脑组织海马神经细胞损伤或凋亡。同时，内皮糖萼损伤引发的应激反应会进一步加重炎症反应，加速老年痴呆疾病的发展。本研究通过构建大鼠老年痴呆模型，从脑组织内皮糖萼角度初步探讨分析盐酸多奈哌齐联合脑脉通治疗老年痴呆的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选择无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠50只[购于南京青龙山动物繁殖场，合格证号：SCXK(苏)2017-0001]，体质量200～250 g，饲养条件为温度(25±2)℃，相对湿度(55±5)%，给予水分和普通饲料适应性饲养1周。本实验已通过南京市溧水区人民医院动物委员会批准同意[科研伦审〔2018〕第18号]。

1.2 药物与试剂 盐酸多奈哌齐[国药准字：H20070181，规格：10 mg，卫材(中国)药业有限公司生产]；脑脉通(医院内制剂，组成：大黄9 g，葛根9 g，人参6 g，川芎6 g)，白细胞介素(IL)-6、IL-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒采购于南京森贝伽生物科技有限公司；神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)免疫组化试剂盒采购于南京建成生物工程研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 老年痴呆大鼠模型的建立 SD大鼠正常饲养1周后，造模前禁食12 h，自由饮水，随机分为空白组、模型组、盐酸多奈哌齐组、脑脉通组与联合用药组，每组10只。除空白组大鼠外，其余各组均皮下注射D-半乳糖150 mg/(kg·d)，连续6周，第7周双侧海马区注射10 μg聚集肽Aβ25～35，建立老年痴呆大鼠模型[6-7]。建模完成后通过比较空白组与各组模型大鼠行为学判断建模是否成功。造模过程中模型组大鼠死亡1只，联合用药组大鼠死亡1只，脑脉通组1只大鼠造模失败。

1.3.2 给药方法 建模成功后，空白组和模型组给予生理盐水2.50 mL/(kg·d)灌胃，盐酸多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐0.85 mg/(kg·d)灌胃，脑脉通组给予脑脉通复方制剂1.50 g/(kg·d)灌胃，联合用药组同时给予盐酸多奈哌齐0.85 mg/(kg·d)与脑脉通1.50 g/(kg·d)灌胃。持续灌胃给药8周。

1.4 取材与观察指标 分别于给药前、给药1周、3周、5周和8周时，采用内眦静脉采血，收集各组大鼠静脉血，2 500 r/min离心10 min，取上清液转移到已消毒的EP管内，-80 ℃保存。检测各组大鼠给药前及给药1周、3周、5周、8周时内皮糖萼损伤标志物(Syndecan-1、硫酸乙酰肝素)水平。

给药8周后以断颈方式处死各组大鼠，取脑组织，采用甲醛固定，制备病理切片，苏木素-伊红(HE)染色，于光学显微镜下观察各组大鼠脑组织形态。采用ELISA试剂盒检测各组大鼠10%脑组织匀浆中IL-6、IL-1及TNF-α含量。采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织BDNF、NGF蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织海马区HE染色结果 空白组脑组织海马神经细胞排列规则，数量正常；模型组脑组织海马神经细胞层次不清，呈现无规律性排列，且数量较少；盐酸多奈哌齐组脑组织海马神经细胞排列稍显规律性，数量较模型组增多；脑脉通组脑组织海马神经细胞排列趋于规律性，数量增多；联合用药组脑组织海马神经细胞排列恢复一定的规律性，数量增多。详见图1。

图1 各组大鼠脑组织海马区HE染色结果(×100)

2.2 各组大鼠脑组织炎性因子水平 与空白组比较，模型组、盐酸多奈哌齐组和脑脉通组大鼠IL-6、IL-1、TNF-α水平升高(P<0.05或P<0.01)，联合用药组与空白组炎性因子水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，盐酸多奈哌齐组、脑脉通组和联合用药组炎性因子水平降低(P<0.05或P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠脑组织炎性因子水平比较 (±s)

2.3 各组大鼠脑组织BDNF、NGF蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组、盐酸多奈哌齐组、脑脉通组与联合用药组BDNF表达水平均降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和脑脉通组BDNF表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，联合用药组BDNF表达水平升高(P<0.01)。与空白组比较，模型组、盐酸多奈哌齐组和脑脉通组NGF表达水平降低(P<0.05或P<0.01)，联合用药组NGF表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和脑脉通组NGF表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，联合用药组NGF表达水平升高(P<0.01)。详见表2、图2。

表2 各组大鼠脑组织BDNF、NGF蛋白表达水平比较 (±s)

图2 各组大鼠BDNF、NGF蛋白表达情况(免疫组化，×200)

2.4 各组大鼠灌胃前及灌胃给药不同时间点内皮糖萼损伤标志物水平比较 空白组大鼠血清中糖萼损伤标志物(Syndecan-1和硫酸乙酰肝素)水平较低，且整个研究过程中无明显变化。其他4组老年痴呆模型大鼠灌胃前Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平高于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)，且模型组Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平在研究过程中无明显变化。与模型组比较，盐酸多奈哌齐组和脑脉通组在灌胃5周时，联合用药组在灌胃3周时，血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与盐酸多奈哌齐组和脑脉通组比较，联合用药组灌胃5周时血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，但其水平仍高于空白组(P<0.05)。各组大鼠不同时间点血清Syndecan-1和硫酸乙酰肝素水平变化见图3、图4。

图3 各组大鼠不同时间点血清Syndecan-1水平变化

图4 各组大鼠不同时间点血清硫酸乙酰肝素水平变化

3 讨 论

老年痴呆的发生与神经原纤维缠结、乙酰胆碱含量降低、氧化应激及炎症反应等相关。神经原纤维缠结因神经细胞内丝氨酸蛋白激酶3β被激活，上调微管相关Tau蛋白过度磷酸化产生，进而导致细胞骨架失稳及记忆功能障碍。Tau蛋白过度磷酸化与氧化应激反应密切相关[8-9]。盐酸多奈哌齐为选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能够可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶引起的乙酰胆碱水解进而增加受体部位的乙酰胆碱含量，改善老年痴呆，但治疗具有一定的局限性，且存在副作用[10]。脑脉通由大黄、人参、葛根、川芎组成，具有抗炎、抗氧化、改善脑缺血的作用[11]。多年临床实践发现，盐酸多奈哌齐联合脑脉通治疗老年痴呆效果较好，但其治疗机制尚未阐明。

中医学认为“痴呆”“呆病”与瘀血、痰浊等密切相关，与“热”“毒”有关，抗炎、抗氧化作用的中药对老年痴呆的治疗可能存在重要潜力。老年痴呆病人血清炎性因子水平普遍高于正常人[12-13]，炎性因子能够刺激细胞产生大量的活性氧簇，损伤血脑屏障和受损的细胞膜，加重氧化应激反应和神经退化[14]。糖萼是覆盖于血管内皮细胞内侧的一种绒毛状多糖-蛋白复合结构，对于维持血管通透性具有至关重要的作用，炎症反应、氧自由基、缺血再灌注等多种因素均会造成糖萼结构受损[15-16]。老年痴呆病人通常伴有炎症反应、高氧化应激水平，炎性因子及氧自由基造成糖萼受损，引起脑组织血管通透性升高，进一步促进炎症反应，加重氧化应激水平，形成不良循环。脑脉通中大黄的主要活性成分大黄素及大黄鞣质具有较强的抗炎作用，可有效降低炎性因子水平；人参的主要活性成分人参皂苷具有较强的抗氧化能力，可降低氧化应激水平，有效改善缺血再灌注状态[17-19]。

联合用药组糖萼损伤标志物及炎性因子水平显著降低，海马神经细胞数量增多，恢复规则性排列，推测脑脉通可能通过改善内皮糖萼损伤，降低炎症反应，进而修复海马神经元细胞，改善老年痴呆。同时盐酸多奈哌齐是特异性可逆乙酰胆碱酯酶抑制剂，可有效抑制乙酰胆碱水解，增加乙酰胆碱含量，改善老年痴呆。盐酸多奈哌齐和脑脉通联合用药可通过抑制乙酰胆碱酯酶水解，修复内皮糖萼，降低炎症反应，发挥协同治疗老年痴呆的作用。

综上所述，盐酸多奈哌齐联合脑脉通可促进大鼠脑组织海马神经细胞数量及排列恢复，提高神经营养因子BDNF和NGF水平，治疗老年痴呆效果较好。其作用机制可能是脑脉通修复内皮糖萼、降低炎症反应及盐酸多奈哌齐抑制乙酰胆碱酯酶进而协同发挥治疗效果。