杨晓忱，张 云，刘咏梅，王 阶

随着降压药、降脂药接连上市及广泛应用，心脑血管疾病的发生率和病死率在欧美等西方国家逐渐降低，而该病发病率、病死率在我国近年来仍不断增加。我国心血管事件年发病率为50/10万，而脑卒中年发病率为250/10万，是心血管事件的5倍[1]，已成为我国居民的首位死因[2]。高血压作为心脑血管疾病共同的主要危险因素之一，目前其治疗率、控制率仍处于较低水平。因此，进一步寻求和探索导致我国心脑血管疾病高发和持续发展的可干预危险因素具有重要意义。补肾降压方是临床有效降压经验方，由生地、杜仲、山萸肉、天麻、丹皮、泽泻、三七、山楂等组成，临床应用30余年，相关临床研究获得院内伦理审查批号(2019-186-KY-01)及国家药品监督管理局颁发的药物临床试验批件(ChiMCTR1900002876)，主要用于治疗1级、2级原发性高血压，临床疗效明显。本团队前期研究中对补肾降压方治疗高血压的机制进行相关基础研究[3-11]，研究表明，补肾降压方降压效果稳定，具有调节糖脂代谢与水钠代谢、逆转靶器官损害的作用，其机制与上调miR-1抑制胞外信号调节激酶(ERK)通路，调节lncRNA-mRNA网络，激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路，抑制内皮细胞(ECs)凋亡，抑制核因子-κB(NF-κB)通路，抑制炎症反应等有关。但由于复方研究的复杂性，其机制研究面临一定的困难，作用机制研究尚停留在经典药理学层面，缺乏系统性。本研究采用网络药理学方法，探索补肾降压方药效学及其治疗高血压的多靶点机制。通过运用整合药理学中药平台[12-14]，构建补肾降压方的药物靶标和疾病靶标之间的相互作用网络及 “中药-化学成分-核心靶点-关键通路”多维多系统网络，挖掘补肾降压方降压作用的关键靶标和信号通路，以期为补肾降压方治疗高血压提供依据。

1 资料与方法

1.1 补肾降压方活性成分的搜集与筛选 本研究重点运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，该平台主要分析药物、靶标与疾病之间的关系[15]。网址为http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，BSJY复方组成：杜仲、天麻、生地、丹皮、泽泻、三七、山楂、山萸肉。主要提取口服生物利用度(OB)、生物半衰期(HL)、药物相似度(DL)等化合物药代动力学特征。若TCMSP未收录，则使用TCMID数据库[16]，该数据库主要收集中医方剂、草药和草药成分及现代药理学信息。通过2个数据库获得补肾降压方成分后，以吸收A、分布D、代谢M、排泄E为标准，即ADME；本方属于口服制剂，设置该参数为OB≥30%，HL≥4 h，DL≥0.19，以排除无法在体内正常代谢成分的干扰。

1.2 补肾降压方活性成分及相关靶标的检索 收集补肾降压方组成中药的化学活性成分，然后通过“TCMSP靶向预测”界面平台集成的药库数据库，与补肾降压方所含化学成分进行对比，预测补肾降压方中所含活性成分的潜在靶标，选择可能性score≥0.8。

1.3 补肾降压方活性成分靶标-疾病靶标网络的构建 对Therapeutic Target Database(TTD)、Drugbank(版本5.0)[17]等生物学数据库资源中高血压相关靶标进行检索[18]，输入“hypertension”作为关键词，收集其疾病靶标，将两个数据库检索结果合并、去重后作为疾病靶点数据库备用。前者中筛选出已证实的高血压相关疾病靶点或上市的高血压临床药物相关靶点，与作用相关的补肾降压方靶点之间进行提取，建立药物靶点与疾病靶点之间作用网络，以及成分靶点-疾病基因互作网络。运用Venn Diagram韦恩图对疾病靶点和成分靶点进行分析，探寻中药如何通过共有靶点发挥治疗作用。

1.4 补肾降压方成分靶标-疾病靶标网络拓扑学分析 本研究对网络节点中的评价采用网络拓扑参数[19]，包括自由度(degree)：生物功能参与越多，degree越大；平均最短路径长度(average shortest path length)：值越小说明在网络中越重要；靠近中心性(closeness centrality)、介数(betweenness centrality)：在网络信息中发挥越重要的作用，节点值越大。筛选高血压关键靶点、中药靶点与疾病蛋白相互作用网络Hub节点，构建核心网络图。

1.5 “中药-成分-靶标-通路”网络构建与潜在分子机制挖掘 为了更加直观地反映补肾降压方中组分-靶标和通路之间的关系，使用DAVID v 6.8数据库[20]构建补肾降压方成分-靶标网络靶点，核心靶点运用基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，筛选具有统计学意义(P<0. 01) 及排名前20位的通路，针对关键通路(关键核心靶标参与)，使用 Cytoscape工具构建网络药理图进行展示。

2 结 果

2.1 补肾降压方所含成分及其预测靶标概况 通过整合药理学平台中药成分数据库共汇集了补肾降压方中8种单味中药共93种可被口服吸收的化学成分，其中杜仲13个、地黄10个、天麻23个、山茱萸16个、牡丹皮9个、泽泻10个、三七7个、山楂5个。根据药物数据库中药物的相似性评分，≥0.8时这种药物被认为与补肾降压方中所含的化学成分具有高度相似性。将得到补肾降压方“成分-靶标”信息与Drugbank和TTD等生物学数据库资源中高血压相关靶标取交集，运用韦恩图分析疾病靶点和成分靶点(见图1)。由此产生的组分-目标被分配给组分和目标以及补肾降压方中含有药物，以获得每一种药物对应的目标信息(见表1、表2)。

图1 补肾降压方与高血压疾病靶点韦恩图

表1 补肾降压方中药-成分-靶标基本信息

表2 补肾降压方活性成分对应靶点与高血压疾病相关靶点共有交集

2.2 补肾降压方成分靶标-疾病靶标网络构建及潜在分子机制挖掘 高血压疾病靶点与补肾降压方药物靶点的网络构建提取到566对相互作用和146个节点。运用Cytoscape并根据degree对候选靶点进行拓扑学参数分析，共筛选到关键靶点75个，相互作用联系146个关键节点，针对结果进行网络构建(见图2)；选取自由度排名前20位的靶点(见表3)。结果显示，前20个靶点中自由度最大的靶点为蛋白Tp非受体1型(PTPN1)，自由度为29；其次为羟类固醇11-β脱氢酶2(HSD11B2)，自由度为28。自由度越大说明该靶点与更多靶点存在靶向关系，在网络中具有重要的作用。而平均最短路径的靶点依次为5-羟色胺受体2A(HTR2A)、PTPN1、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)等，平均最短路径反映靶点与其他靶点在网络中的距离，距离越近则与其他靶点关系越密切，在网络中越重要。接近中心性排名前5位：HTR2A、PTPN1、IGF1R、HSD11B2、碳酸酐酶2(CA2)；介数排名前5位依次为：CA2、HTR2A、PTPN1、IGF1R、HSD11B2。由此可见，本网络中介数与接近中心性较大的靶点同时也是自由度大、平均最短路径最小的靶点。综合以上参数表明，HSD11B2、PTPN1、IGF1R、HTR2A、CA2等靶点可能是补肾降压方治疗高血压的潜在靶点。

图2 中药靶标-疾病基因互作网络中的核心节点网

表3 补肾降压方治疗高血压的候选靶标拓扑学参数

(续表)

2.3 补肾降压方成分靶标-疾病靶标-通路的构建与分析 为进一步明确核心关键靶标的生物学功能，使用DAVID数据库工具通过GO和KEGG针对补肾降压方成分-靶标网络关键核心节点进行通路富集分析，筛选具有统计学意义(P<0.01)及排名前20位的通路，得到关键核心靶标参与的关键通路信息(见表4)。可以看出该部分靶标显著富集于多条与高血压相关的通路，包括：血压调节(regulation of blood pressure)、钙信号通路(calcium signaling pathway)、蛋白信号传导(G-protein signaling，coupled to cyclic nucleotide second messenger)、醛固酮调节钠的重吸收(aldosterone-regulated sodium reabsorption)、血管平滑肌收缩(vascular smooth muscle contraction)等。

表4 关键靶标功能信息与通路信息

2.4 中药-成分-靶标-通路及潜在分子机制挖掘 构建Cytoscape网络图(见图3)，来自补肾降压方的8味中药且都有贡献的49个活性成分，其中对应靶点数目最多(18个)的为邻苯二酚单乙酸盐来自泽泻；其次对应靶点数目17个的为棕榈油酸甲酯来自地黄；对应靶点数目16个的有如下成分：β-谷固醇来自杜仲、山茱萸、三七；牛磺酸来自天麻；单酚Alisol B与Alisol，B，23-乙酸盐来自泽泻；对应靶点数目14个的有如下成分：(-)-[(-)-烟碱单宁]来自杜仲，四氢精氨酸来自山茱萸，香豆酚C来自泽泻；槲皮素来自杜仲、牡丹皮、三七、山楂，对应9个重要靶点。山萘酚来自杜仲、牡丹皮、山楂，对应7个重要靶点。靶点网络特征分析见表5。所预测补肾降压方中有49个活性成分与肾上腺素受体(ADRA1B、ADRB1、ADRB2、ADRB3)、钙电压门控通道亚基(ca CACNA1C、CACNA1G)、腺苷受体(ADORA1、ADORA2A、ADORA2B)、多巴胺受体(DRD1、DRD2)、内皮素受体(EDNRA、EDNRB)、一氧化氮合酶(NOS2、NOS3)、精氨酸加压素受体1A(AVPR1A)、HTR2A、胰高血糖素受体(GCGR)、葡萄糖激酶(GCK)、血红素加氧酶1(HMOX1)、胰岛素受体(INSR)、神经肽Y受体Y1(NPY1R)、蛋白质酪氨酸激酶2β(PTK2B)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)等30个主要靶点有很强的相互作用。网络富集分析显示，通过血压调节、钙信号通路、血管平滑肌收缩、醛固酮调节钠的重吸收等 15 条通路，调节钙钠离子转运、血管内皮功能、糖脂代谢等参与血管舒张、调节离子转运、改善胰岛素抵抗、调节机体代谢等。

图3 关键靶标的 KEGG 通路及GO功能富集分析

表5 补肾降压方候选成分筛选

(续表)

3 讨 论

高血压的治疗使血压得到控制，脑卒中明显减少，但对心血管死亡率影响较小[21]。这可能与未注意纠正与代谢紊乱有关的各种心血管危险因素相关[22]。研究数据显示，高血压病人中血脂异常约占总病例数的69.5%，血糖异常约占55.3%[23]；中医药在治疗高血压前期、高血压、肥胖性高血压、难治性高血压等方面积累了大量经验，复方药物既能改善临床症状，也能稳定血压，平稳降压，保护靶器官，改善危险因素，使部分病人达到停药减量目的[24-25]。中医学认为高血压分为“眩晕”和“头痛”，补肾降压方临床应用30余年，用于治疗1级、2级原发性高血压，临床疗效确切[26]。本研究采用网络药理学方法研究补肾降压方的降压机制。

本研究应用ADME分析筛选得到93种可被口服吸收的化学成分，其中杜仲13个、地黄10个、天麻23个、山茱萸16个、牡丹皮9个、泽泻10个、三七7个、山楂5个。“中医药-成分-目标-路径”网络，来自补肾降压方8味中药且都有贡献的49个活性成分，其中对应靶点数目最多为邻苯二酚C单乙酸盐，来自泽泻，其次为棕榈油酸甲酯，来自地黄；再次为β-谷固醇，来自杜仲、山茱萸、三七，牛磺酸来自天麻，单酚Asolol B与Alisol，B，23-乙酸盐来自泽泻；以及槲皮素、山萘酚、天麻素等，具有明显抗高血压相关作用。天麻素能通过PKA依赖性信号通路激活血管平滑肌中的ATP敏感性钾通道(KATP)，引起血管舒张[27]，从而起到降压作用[28]。山萘酚来自杜仲、牡丹皮、山楂，可内皮依赖性舒张血管，并可抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)导致的血管重构[29]；而来自杜仲、牡丹皮、三七、山楂的槲皮素为天然黄酮类降压成分，今后的研究可重点进行更多补肾降压方抗高血压作用的有效成分如山萘酚、天麻素等与槲皮素(源于杜仲、牡丹皮、三七、山楂)之间降血压的协同药效和机制研究。

网络富集分析预测补肾降压方中有49个活性成分与治疗高血压预测82个共有靶基因，并与肾上腺素受体、腺苷受体、多巴胺受体、内皮素受体、一氧化氮合酶、精氨酸加压素受体1A、HTR2A、胰高血糖素受体、葡萄糖激酶、血红素加氧酶1、胰岛素受体、神经肽Y受体Y1、蛋白质酪氨酸激酶2β、过氧化物酶体增殖物激活受体等30个主要靶点有很强的相互作用。所涉及≥10 个靶点共同富集的15条关键通路，参与高血压病理过程的不同环节如调节钙钠离子转运、血管内皮功能、糖脂代谢等。

值得一提的是，山萘酚与槲皮素对胰岛素受体等与糖脂代谢相关的mRNA靶基因有作用。既往研究表明，槲皮素可促进PI3K-Akt-eNOS通路激活，保护内皮功能、改善胰岛素抵抗[30-32]；而补肾降压方前期研究已证实可上调血清脂联素水平，增加胰岛素敏感性，提示应用补肾降压方改善自发性高血压大鼠(SHR)胰岛素抵抗机制可能与提高血清脂联素水平有关，因此，本研究为进一步探索其药理机制指明方向并提供基础。

4 小 结

本研究探讨补肾降压方在高血压治疗中的潜在“活性成分-靶点途径”网络药理学机制，得到93种可被口服吸收的化学成分(杜仲13个、地黄10个、天麻23个、山茱萸16个、牡丹皮9个、泽泻10个、三七7个、山楂5个)。补肾降压方主要通过参与高血压病理过程的不同环节，如调节钙钠离子转运、血管内皮功能、糖脂代谢等舒张血管、改善胰岛素抵抗。然而，目前预测出的网络模型得出的高血压降压机制还有待进一步药效学验证。本研究关于胰岛素抵抗结果与实验研究基本一致，未来将进一步结合课题组前期对补肾降压颗粒高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)指纹图谱分析，完善补肾降压颗粒制剂的质量控制。本研究应用网络药理学方法对补肾降压方降压机制进行研究，探寻补肾降压方的有效成分、治疗靶点及信号通路，对阐释补肾降压方的降压机制具有一定参考意义。