马璐璐，张璐莎，李春晓，张丽媛，杨文杰，方乐玉，王倩怡，陈 璐，王 虹

疏血通注射液临床上用于治疗急性期脑梗死，中医辨证为瘀血阻络所致的缺血性中风病中经络急性期[1]。缺血性脑中风是由于动脉血管壁病变，血液成分改变，形成血栓，阻塞脑的供血动脉，缺血缺氧所致的局限性脑组织缺血性坏死或软化，从而出现相应的神经系统功能缺损[2]。在血栓形成中血小板活化起重要作用[3]，现代药理学研究发现，疏血通注射液可以通过抗血小板活化达到抗凝、溶栓效果[4]，但其抗血小板活化作用机制尚不明确。本研究通过模拟缺氧及氧化应激环境，观察疏血通注射液对血小板功能，包括对血小板聚集、黏附、活化的影响，并探讨其潜在的作用机制，揭示其科学内涵，指导临床科学合理用药。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，无特定病原体(SPF)级，雄性，体质量200～220 g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。

1.2 药品与试剂 疏血通注射液，规格：2 mL，批号：国药准字Z20010100，牡丹江友博药业有限责任公司生产；过氧化氢(H2O2)，规格：30 g/L，卫生许可证号：赣卫消证字(2010)第0022号，江西草珊瑚消毒用品有限公司生产；二磷酸腺苷(ADP)，批号SLBN0134V，美国Sigma-Aldrich公司生产；荧光探针CM-H2DCFDA、罗丹明标记鬼笔环肽，美国Thermo Fisher Scientific公司生产；APC anti-mouse/rat CD62p antibody，美国 Biolegend 公司生产；GAPDH、细胞外信号调节激酶5(ERK5)、磷酸化细胞外信号调节激酶5(p-ERK5)、p70核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p-P70S6K)，美国CST公司生产；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；水合氯醛，成都市科龙化工试剂厂生产；改良台式液、改良台式液(无钙)，上海源叶生物科技有限公司生产；柠檬酸、柠檬酸铵、葡萄糖、氯化铁，天津市风船化学试剂科技有限公司生产。

1.3 仪器 倒置荧光显微镜，日本Nikon公司生产；Flex Station®3酶标仪，美国Molecular Device公司生产；流式细胞仪，美国BD公司生产；多功能酶标仪，美国BioTek公司生产；64R型低温高速离心机，美国Beckman公司生产；电泳仪、转膜仪，美国Bio-Rad公司生产；超灵敏多功能成像仪，美国GE公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 血小板悬液的制备 SD大鼠，5%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血10 mL，放入盛有ACD(柠檬酸38 mmol/L 、柠檬酸钠75 mmol/L、葡萄糖124 mmol/L)的1.5 mL离心管中摇匀，1 200 r/min离心10 min，取上清部分，即为富血小板血浆PRP，3 000 r/min离心10 min，沉淀部分即为血小板，在血小板改良台式液(无钙)中洗2次，用改良台式液稀释成适当浓度，使其吸光度值在1左右。

1.4.2 微孔法检测血小板聚集率 分离血小板，检测20 μmol/L ADP、2.5 mmol/L 花生四烯酸(AA)、0.4 U/mL凝血酶(Thrombin)诱导的血小板聚集率以及加入不同比例配置的疏血通注射液(1∶32、1∶64、1∶128)后的聚集率。用微孔法测血小板聚集率，使用酶标仪检测波长405 nm处样品的OD值。

1.4.3 分组及给药 本研究包括两种模型，即1% O2诱导的缺氧模型和500 μmol/L H2O2诱导的氧化应激模型，37 ℃孵育10 min。血小板分为空白对照组、模型组、疏血通注射液低浓度组、疏血通注射液中浓度组、疏血通注射液高浓度组。模型组及空白对照组给予Buffer A(130 nmol/L氯化钠、10 mmol/L柠檬酸钠、9 mmol/L碳酸氢钠、6 mmol/L葡萄糖、0.9 mmol/L氯化镁、0.81 mmol/L磷酸二氢钾、10 mmol/L Tris-base)，疏血通注射液低、中、高浓度组分别将疏血通注射液用Buffer A按1∶12.8、1∶6.4、1∶3.2比例稀释为10×工作液待用。

1.4.4 血小板在纤维蛋白原上的黏附 准备载玻片，包被50 μg/mL纤维蛋白原溶液150 μL，4 ℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗去未结合的纤维蛋白原，血小板与生理盐水、不同比例稀释的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1% O2或H2O2诱导10 min，取血小板悬液150 μL加到包被有纤维蛋白原的载玻片上，37 ℃孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗3次，除去多余的多聚甲醛，采用鬼笔环肽对血小板避光标记20 min，荧光显微镜下观察并随机选取视野拍照，Image J软件测量血小板面积。

1.4.5 血小板活性氧(ROS)检测 分离血小板，分别与生理盐水、低中高浓度的疏血通注射液于37 ℃，孵育20 min，1% O2或H2O2于37 ℃孵育10 min，与10 μmol/L CM-H2DCFDA，37 ℃避光孵育20 min，PBS洗3次，用多功能酶标仪在激发波长488 nm、发射波长528 nm处检测各组血小板平均荧光强度。

1.4.6 血小板膜蛋白CD62p表达的检测 分离血小板，分别与生理盐水、不同比例稀释的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1%O2或H2O2于37 ℃，孵育10 min，加入CD62p-APC抗体，室温避光孵育30 min，加入500 μL 1%多聚甲醛，充分混匀，用流式细胞仪分析检测血小板CD62p的荧光强度。

1.4.7 蛋白免疫印迹法检测p-P70S6K、P70S6K、p-ERK5、ERK5蛋白表达 分离血小板，分别与生理盐水、不同浓度的疏血通注射液于37 ℃孵育20 min，1%O2或H2O237 ℃孵育10 min，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5%BSA的TBST溶液封闭3 h，分别加入p-P70S6K、P70S6K、p-ERK5、ERK5一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，TBST洗膜4次，每次10 min。采用化学发光法检测，图像扫描分析。用Image J软件对各蛋白条带的灰度值进行半定量分析，并记录实验结果。

2 结 果

2.1 疏血通注射液对ADP、AA、Thrombin诱导大鼠血小板聚集的影响 疏血通注射液中浓度组和高浓度组对ADP、AA、Thrombin诱导的大鼠血小板聚集有抑制作用，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；疏血通注射液低浓度组对AA诱导的大鼠血小板聚集有抑制作用，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。详见图1。

2.2 疏血通注射液对大鼠血小板黏附的影响 在1% O2诱导的低氧损伤模型中，疏血通注射液低浓度组、中浓度组和高浓度组降低了血小板与胶原的黏附，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.001)。详见图2。在H2O2诱导的氧化应激模型中，疏血通注射液低浓度组、中浓度组和高浓度组降低了血小板与胶原的黏附，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.001)。详见图3。

与模型组比较，＊ P<0.05；# P<0.01。

与模型组比较，＊ P<0.001。

与模型组比较，＊ P<0.001。

2.3 疏血通注射液对大鼠血小板ROS水平的影响 在1% O2诱导的低氧损伤模型中，疏血通注射液低中浓度组和高浓度组降低了ROS的产生，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图4A。在H2O2诱导的氧化应激模型中，疏血通注射液低浓度组、中浓度组和高浓度组降低了ROS的产生，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图4B。

与模型组比较，＊ P<0.05。

2.4 疏血通注射液对大鼠血小板CD62p表达的影响 在1% O2诱导的低氧损伤模型中，疏血通注射液中浓度组和高浓度组降低了CD62p的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图5A。在H2O2诱导的氧化应激模型中，疏血通注射液低浓度组和中浓度组降低了CD62p的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图5B。

与模型组比较，＊ P<0.05。

2.5 疏血通注射液对血小板p-ERK5、p-P70S6K蛋白表达的影响 在1% O2诱导的低氧损伤模型中，疏血通注射液低、中、高浓度组ERK5磷酸化以及P70S6K磷酸化降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图6A、6B。在H2O2诱导的氧化应激模型中，疏血通注射液中、高浓度组ERK5磷酸化降低。详见图7A；疏血通注射液高浓度组可降低P70S6K磷酸化，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图7B。

与模型组比较，＊ P<0.05。

与模型组比较，＊ P<0.05。

3 讨 论

本研究结果显示，疏血通注射液可抑制ADP、Thrombin、AA诱导的血小板聚集，抑制缺氧及氧化应激导致的血小板活化，表明疏血通注射液具有抗血小板、抗血栓的作用。

缺血性脑中风最常见的发病机制为动脉粥样硬化，血小板在斑块破裂时通过凝血酶原的暴露而激活[5]，促进血栓形成、脑血管闭塞，最终导致缺血性脑中风的发生[6]。血小板活化与脑缺血缺氧后继发性脑损伤有关，脑梗死后，缺血缺氧微环境中炎性因子和ROS均迅速增加，导致血小板持续活化，活化的血小板可以释放组织因子及炎性因子，进而激活凝血纤溶系统，在缺血区募集免疫细胞，加重心脑血管损伤[7]。也有研究表明，高原地区人群因长期在缺氧环境下易形成血栓[8]。机体正常的新陈代谢会产生活性物质，维持机体的正常运转，但过多的活性物质会导致氧化应激，对机体造成损伤[9-10]。ROS家族中的H2O2是机体氧化代谢的产物，能够刺激血小板活化[11]。

血小板作为最小的血液成分，在血栓形成和止血中起中枢介质的作用。在血管内皮受到损伤时，皮下基质蛋白(如胶原或黏连蛋白)或内源性激动剂(如ADP)暴露于循环中，与血小板表面膜上糖蛋白受体相互作用，触发黏附[12-14]，黏附的血小板进一步活化周围血小板，使其释放α颗粒、致密颗粒内容物、溶菌酶等，经历伪足形式的形状变化，聚集形成多聚体。ROS在血小板活化中的作用已被研究，早期报道主要表明ROS超载诱导血小板活化[15-16]。CD62p储存于血小板的α颗粒和内皮细胞中，在血小板活化和脱颗粒过程中重新分布到质膜上，并介导活化的内皮细胞或血小板与白细胞的相互作用。有研究表明，疏血通注射液具有抗血小板[1]、抗凝[17]、促纤溶[18]、抗炎[19]和促神经保护[20]等作用。本研究结果显示，疏血通注射液可抑制多种诱导因子诱导的血小板聚集，抑制缺氧或H2O2诱导的血小板与胶原蛋白的黏附、ROS水平以及CD62p的释放，提示疏血通注射液可抑制血小板活化。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族对细胞的氧化应激敏感[21]，是血小板信号通路的重要组成部分。在血小板中发现了MAPK家族成员ERK5，ERK5是一种对氧化应激非常敏感的蛋白激酶，在心脑缺血期间作为ROS的感应器，促进氧化还原、血小板信号转导[22]，有研究表明，在缺氧、富含ROS的环境中激活并介导受体信号传导机制。研究发现ERK5调节心肌梗死后血小板蛋白表达，其下游P70S6K是血小板活化所需的信号转导元件[23]，ERK5缺陷小鼠的血小板在心肌梗死后活化减弱，与P70S6K在心肌梗死后表达降低一致[24]。本研究结果显示，疏血通注射液可抑制ERK5和P70S6K的磷酸化，提示疏血通注射液抑制血小板活化可能与其抑制ERK5/P70S6K信号通路有关。

综上所述，疏血通注射液可通过抑制ERK5/P70S6K信号通路，抑制缺氧及H2O2诱导的血小板聚集、黏附与释放，从而抑制血栓形成，为疏血通注射液的抗血小板治疗提供了科学依据。