陈 彭，黄永锋，赵 斌，张 宏，薛亚妮，朱 江

脑梗死是人体脑组织内血管因各种因素堵塞，而导致血液难以通畅运行，使脑组织缺血、缺氧，是中老年人群中的高发疾病[1]。 脑梗死也称缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)，是临床常见的脑血管疾病，其致死、致残率极高，在我国急性缺血性卒中占全部卒中的60%～80%[2]。脑梗死的发病率逐年增加，大部分病人因就医不及时，而错过静脉溶栓治疗时机，因此，时间窗外的有效治疗和干预成为目前研究的焦点。脑梗死病因多，发病机制复杂，遗传、家庭因素的相互作用是本病发病的中心环节。急性脑血栓形成时，血小板的活化、黏附和聚集是最重要的病理过程，因此，抗血小板聚集的药物阿司匹林在临床上被广泛应用于脑血管疾病的Ⅰ级、Ⅱ级预防，近年来，研究证实，许多病人对抗血小板聚集治疗药物的反应存在个体差异，导致阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)的可能性增加，有研究提示阿司匹林抵抗的可能影响因素包括性别、年龄、体质指数、2型糖尿病、合并用药等[3]。临床上许多病人尽管已规律服用阿司匹林，但仍会发生急性脑血栓，即发生阿司匹林抵抗[4]，阿司匹林抵抗的确切定义并没有完全统一，其主要包括“临床型阿司匹林抵抗”和“生化型阿司匹林抵抗”两个方面[5]。阿司匹林抵抗的发生机制限制了其临床效果，但其具体机制尚未明确[6]。

血小板在急性脑梗死的发展中发挥着重要作用，目前有研究发现微小RNA与血小板活化密切相关。Willeit等[7]发现增加阿司匹林的剂量，血小板抑制效率可以增加，而血小板抑制效率增加进一步能够引起血浆miR-126和miR-223的减少。因此，循环miRNA可以成为新的血小板激活的生物学标志物[8]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2018年12月于我院神经内科就诊的急性缺血性脑卒中病人58例为病例组，病历资料均完整，诊断全部符合2010年中国急性缺血性脑卒中诊治指南标准。其中男31例，女27例，年龄39～79岁，平均年龄62岁。选取同期60名非脑梗死、心肌梗死的健康体检者作为对照组，其中男34名，女26名，年龄40～78岁，平均年龄59岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。用全血电阻法将58例急性脑梗死病人分为阿司匹林抵抗组和阿司匹林敏感组，其中阿司匹林抵抗组病人18例，阿司匹林敏感组病人40例。受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和设备 Trizol总RNA 提取试剂盒购买于美国 Invitrogen 公司，逆转录及荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购买于大连宝生物工程有限公司，miR-223及内参引物均由上海生工公司设计合成，花生四烯酸(AA)和二磷酸腺苷(ADP)均为美国CHRONO-LOG试剂，ABI实时荧光定量PCRs仪购自美国ABI公司，血小板分析仪是美国CHRONO-LOG560血小板分析仪。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取和定量 按照Trizol(TaKaRa China)试剂盒说明书提取病例组及对照组外周血中总RNA，利用紫外分光光度仪检测所有RNA提取液的吸光度值(OD值)，进一步检测RNA溶液的浓度和纯度，最后进行RNA定量。A260/A280>1.8，方可用于后续检测。

1.3.2 miR的逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR) 先在反应管中进行反转录，再取上述反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，按照RT-PCR(TaKaRa China)说明书，对所有样品设3复孔，总反应体系为20 μL，ABI7500 System反应条件为预变性95 ℃、30 s，延伸95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40个循环。再进行标准曲线的绘制。以miR-16作为内参基因，根据实验结合标准曲线分别计算病例组及对照组外周血中miR-223的表达水平。

1.3.3 血小板聚集率的检测 病例组病人规律清晨空腹服用阿司匹林肠溶片(拜阿司匹林，拜尔医药保健有限公司生产) 100 mg，每日1次，1周后用AA、ADP两种诱导剂诱导后检测血小板聚集率。对照组不服用阿司匹林。3.2%枸橼酸钠防凝全血0.5 mL，用生理盐水1∶1稀释，放在预热位置预热5 min，放入铂金电极，调零，按下CALIBRATE按钮调到50 Ω，加入上述两种诱导剂(AA 10 μL，ADP 10 μL)，5 min后停止，仪器会自动计算出血小板的最大聚集率。

2 结 果

2.1 两组外周血中miR-223表达水平比较 急性脑梗死病人miR-223相对表达量为1.333 1±0.124 2，对照组miR-223的相对表达量为0.709 7±0.059 6，急性脑梗死病人外周血中miR-223的相对表达量较健康体检者升高，差异有统计学意义(P<0.00 1)。详见图1。

图1 两组miR-223表达水平比较

2.2 阿司匹林抵抗组与阿司匹林敏感组miR-223表达水平比较 阿司匹林抵抗发生率为31%。阿司匹林抵抗组miR-223的相对表达量为2.407 9±0.217 9，阿司匹林敏感组miR-223的相对表达量为0.976 5±0.079 8，阿司匹林抵抗组外周血中miR-223的相对表达量较阿司匹林敏感组升高，差异有统计学意义(P<0.00 1)。详见图2。

图2 阿司匹林抵抗组与阿司匹林敏感组miR-223表达水平比较

3 讨 论

脑卒中主要分为出血性和缺血性两大类型，二者在发病机制、病理生理机制以及临床康复和预后等方面均有明显差异[9-10]。我国脑卒中每年新发病例大约200万人次，因脑卒中死亡的病人高达150万人，带病生存的病人中近70%伴有不同程度的后遗症[11]，目前我国脑卒中病人近700余万人，其中60%～80%为缺血性卒中，有文献报道缺血性脑卒中的发病率仍在以每年8.7%的速率增长[12]。尽管病人规律口服阿司匹林，仍会发生急性脑血栓，因此，阿司匹林抵抗的概念逐渐引起大家的关注。Gum[13]指出病人静脉血加入阿司匹林处理后采用ADP诱导的血小板聚集率≥70%或采用AA诱导的血小板聚集率≥20%的标本即为阿司匹林抵抗，反之为非阿司匹林抵抗。因此，更有效地治疗急性脑梗死成为重中之重。

miRNA是一类非编码的微小RNA，其生成经历了原始转录本、前体、成熟体3个过程，最终的成熟体为19～24碱基(nt)大小，成熟体能够与靶miRNA 3′端非编码区特异性结合，然后在翻译和转录后水平调控靶基因的表达[14]。miRNA在脑梗死的发病机制中起着重要作用[15]。有报道显示血液中的miRNAs，也就是循环miRNA水平与脑梗死相关[16]，一些特定的血小板微小RNA与血小板的活性密切相关，血小板中存在大量miRNA，可以通过作用靶mRNA而进一步调节靶蛋白的表达，影响血小板的黏附、聚集、释放等生物活性[17]。

本研究应用RT-PCR检测急性脑梗死病人与健康体检者外周血中miR-223的表达水平，急性脑梗死病人miR-223的相对表达量为1.333 1±0.124 2，健康对照组病人miR-223的相对表达量为0.709 7±0.059 6，急性脑梗死病人外周血中miR-223的相对表达量较健康体检者升高，差异有统计学意义(P<0.00 1)。miR-223在血小板中含量非常丰富[18]。根据本研究结果推测miR-223可能与急性脑血栓的形成密切相关。有研究指出miR-223可能进一步参与血小板对药物的反应性[19-20]。本研究将58例急性脑梗死病人分为阿司匹林抵抗组和阿司匹林敏感组，阿司匹林抵抗组miR-223相对表达量为2.407 9±0.217 9，阿司匹林敏感组miR-223的相对表达量为0.976 5±0.079 8，阿司匹林抵抗组miR-223的相对表达量较阿司匹林敏感组升高，差异有统计学意义(P<0.00 1)。因此，推测miR-223在急性脑梗死病人外周血中高表达可能与急性脑梗死病人服用阿司匹林期间出现耐药存在密切关系。后续将会进一步研究miR-223的下游靶基因，争取从遗传角度为临床上出现阿司匹林抵抗的急性脑梗死病人提供新的治疗靶点，寻找新的治疗方案。