李艳青，赵 方，傅金英△，高 蕊，吴 昕，牛小斌

（1河南中医药大学第二附属医院妇科，河南郑州 450003；2河南中医药大学研究生处，河南郑州 450046；3河南中医药大学第二附属医院检验科，河南郑州 450003）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一种常见的妇科内分泌疾病，其临床表现为持续性无排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样改变及胰岛素抵抗［1］。PCOS 的病因复杂，发病机理尚不明确，但有研究显示，PCOS 患者较正常人体内的氧化应激（oxidative stress，OS）水平明显升高［2-3］，提示OS可能是PCOS发病的潜在诱因，从抗氧化的角度认识该疾病可能会发现新的治疗靶点。目前临床治疗PCOS 多以对症治疗为主（如达英-35 和氟他胺等），但疗效有限且副作用大［4］。而中医药治疗PCOS 疗效温和持久且不良反应少，已成为近些年的研究热点［5］。

黄芪甲苷（astragaloside，AST）是一种从黄芪上提取出来的高纯度药物，具有免疫调节、器官保护、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖及改善胰岛素抵抗活性等多种生物活性［6-7］。由于黄芪甲苷含量少、效果好，药效强度是黄芪多糖的2 倍以上而享有“超级黄芪多糖”的美称，但目前尚无黄芪甲苷在治疗PCOS 方面的报道。本研究拟通过来曲唑诱导建立PCOS 大鼠模型，观察黄芪甲苷对PCOS 大鼠血清性激素、氧化应激水平及卵巢组织形态学的影响，探讨其对PCOS 大鼠性激素水平和氧化应激损伤的影响，为黄芪甲苷治疗PCOS提供实验基础。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级雌性SD 大鼠60 只，6～7 周龄，体质量（180±20）g，由河南省实验动物中心提供，合格证号SCXK（豫）2017-0002。大鼠饲养于河南中医药大学实验动物中心，室内温度（22±2）℃，相对湿度50%～70%。

1.2 主要试剂 黄芪甲苷（成都科程生物科技开发有限公，批号20180512）；来曲唑片（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号16113061）；达英-35（拜耳医药保健有限公司，批号333A）；苏木素-伊红（HE）染色液（苏州卡尔文生物科技有限公司）；大鼠性激素睾酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2），促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；甾类激素合成急性调节蛋白（steroidogenetic acute regulatory pro⁃tein，StAR）、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 和GAPDH抗体（Abcam，批号分别为ab-13897、ab-60232、ab-173054、ab-181602 和ab-186517）；过氧化物酶标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司，批号BST12E27C55）。

1.3 仪器 680 型酶标仪（Bio-Rad）；TKY-BMC 石蜡包埋机（湖北泰康医疗设备有限公司）；RM2235切片机（Leica）；DYCZ-24DN 型电泳仪和DYCZ-40D 型转膜仪（北京六一仪器厂）；Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统（Media Cybernetics）。

2 方法

2.1 动物造模及分组处理 将60 只大鼠适应性饲养1 周后，随机分成正常对照（control）组、模型组（model）组、阳性对照达英-35（Diane-35）组，黄芪甲苷低剂量（low dose of AST，AST-L）组和黄芪甲苷高剂量（high dose of AST，AST-H）组，每组12 只。PCOS 造模方法参考前期研究［8］，具体操作为将1 mg/kg 来曲唑溶于质量分数1%的羧甲基纤维素（car⁃boxylmethyl cellulose，CMC）溶液中，连续灌胃21 d，制备PCOS 模型，其中正常对照组给予等量1%CMC灌胃。于造模第16 天开始对大鼠进行1 个周期（5 d）的阴道涂片观察动情周期，若阴道上皮细胞持续角化为造模成功［9］。造模成功后开始灌胃给药，根据前期预实验结果，黄芪甲苷低剂量组和黄芪甲苷高剂量组大鼠分别给予12.5 mg/kg 和50 mg/kg 黄芪甲苷灌胃，而达英-35 组大鼠给予0.339 2 mg/kg 达英-35［9］灌胃，对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，每天1次，连续3周。

2.2 阴道涂片观察大鼠动情周期 实验期间每天早上9 点用蘸有生理盐水的无菌棉签缓慢插入大鼠阴道，轻轻地在大鼠阴道内旋转2 圈并将其顺时针均匀地涂在载玻片上，行阴道涂片后自然干燥，苏木素染色，于显微镜下观察细胞种类和形态，同时观察大鼠阴道口径的变化及充血状态，结合阴道涂片检查结果，判断大鼠性周期的各个时期。

2.3 计算卵巢指数 末次给药后，摘取双侧卵巢和双角子宫，用镊子仔细分离并去除脏器表面脂肪组织，滤纸吸拭表面，用分析电子天平称量质量。卵巢指数=两侧卵巢总质量（mg）/大鼠体质量（g）。

2.4 HE 染色观察卵巢组织病理学变化 摘取各组大鼠左侧卵巢组织，放入4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水处理后进行常规石蜡包埋，制作3～4 μm 石蜡切片，行HE 染色，于显微镜下观察卵巢组织形态并拍照。

2.5 ELISA 检测血清中性激素含量 取各组大鼠血清，按照试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的A值，根据标准曲线计算血清中T、E2、LH和FSH的含量。

2.6 比色法检测血清及卵巢组织中SOD、MDA 和GSH-Px 水平 取血清及卵巢组织称质量，组织碾磨至匀浆，4℃、10 000×g离心15 min，取上清液。按照试剂盒操作说明书加入相应试剂，孵育后测各样品吸光度值，根据试剂盒说明书提供的计算公式分别计算MDA和GSH-Px含量及SOD活性。

2.7 Western blot检测 称取适量卵巢组织，加入裂解液充分研磨后置于冰浴中匀浆，然后在4℃、10 500×g条件下离心20 min，收集上清液，BCA 法测定上清液中蛋白含量。取等量蛋白样品进行SDSPAGE，随后转移至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶室温封闭90 min，洗膜，加入Ⅰ抗（StAR、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗体均1∶1 000 稀释），4℃摇床过夜，次日加入HRP标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h，最后使用ECL 显色。利用ImageJ 图像分析软件进行分析，结果用灰度值表示，以目的条带与GAPDH 的灰度值比值，作为目的蛋白表达的相对水平。

3 统计学处理

通过SPSS 22.0 软件进行处理，结果以均数±标准差（meas±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 黄芪甲苷对PCOS模型大鼠动情周期的影响

如表1 所示，对照组大鼠动情周期正常有规律；模型组大鼠动情周期紊乱，动情期消失，动情前期时间延长，说明PCOS 大鼠模型构建成功；黄芪甲苷高剂量组和达英-35 组大鼠大部分处于动情期，周期恢复规律；黄芪甲苷低剂量组大鼠大部分仍处于动情前期阶段，动情期大鼠较少。

表1 各组大鼠动情周期比较Table 1.Comparison of the estrous cycles of rats in each group（n=12）

2 黄芪甲苷对PCOS模型大鼠卵巢指数的影响

如表2 所示，与对照组比较，模型组大鼠卵巢指数显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组和达英-35组大鼠卵巢指数显著减少（P＜0.05），而黄芪甲苷低剂量组无显著变化（P＞0.05）。

3 黄芪甲苷对PCOS 模型大鼠卵巢组织病理结构的影响

如图1 所示，对照组大鼠卵巢表面色泽偏红，表面可见黄体，未见囊状扩张卵泡；模型组和黄芪甲苷低剂量组大鼠卵巢体积变大，表面苍白，少见黄体，可见多个囊状扩张卵泡；黄芪甲苷高剂量组和达英-35组大鼠卵巢体积变小，表面色泽较红润可见黄体，囊状卵泡扩增不明显。

4 黄芪甲苷对PCOS 模型大鼠血清性激素水平的影响

如表3 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中T 和LH 含量显著增加（P＜0.05），E2和FSH 含量显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组和达英-35 组大鼠血清中T 和LH 含量显著减少（P＜0.05），E2和FSH 含量显著增加（P＜0.05）；而黄芪甲苷低剂量组无显著变化（P＞0.05）。

表2 各组大鼠卵巢指数比较Table 2.Comparison of the ovarian index of rats in each group（mg/g.Mean±SD. n=12）

5 黄芪甲苷对PCOS 模型大鼠血清及卵巢组织中氧化应激水平的影响

如表4 和表5 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清及卵巢组织中MDA 含量显著增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD 活性显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组和达英-35 组大鼠血清及卵巢组织中MDA 含量显著减少（P＜0.05），GSH-Px 和SOD 活性显著升高（P＜0.05），而黄芪甲苷低剂量组无显著变化（P＞0.05）。

Figure 1.Pathological changes of ovarian tissue sections（HE staining，scale bar=50 μm）.A：control group；B：model group；C：Diane-35 group；D：AST-L group；E：AST-H group.The ovaries of rats in groups B and D were enlarged，with pale sur⁃face，rare corpus luteum，and multiple cystic dilated follicles.图1 各组大鼠卵巢组织切片病理观察

表3 各组大鼠血清性激素水平比较Table 3.Comparison of serum levels of sex hormones in rats（Mean±SD. n=12）

6 黄芪甲苷对PCOS 模型大鼠卵巢组织中StAR 及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

如图2 和表6 所示，与对照组比较，模型组大鼠卵巢组织中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平显著上调（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著下调（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组和达英-35组大鼠卵巢组织中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平显著下调（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平显著上调（P＜0.05），而黄芪甲苷低剂量组无显著变化（P＞0.05）。

表4 各组大鼠血清中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比较Table 4.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in serum of rats in each group（Meas±SD. n=12）

表5 各组大鼠卵巢组织中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比较Table 5.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in ovarian tissue of rats in each group（Mean±SD. n=12）

Figure 2.The protein expression of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in ovarian tissue detected by Western blot.图2 Western blot 检测卵巢组织中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达

讨 论

OS 是由于机体自由基产生过多，自身清除自由基的能力下降，导致机体氧化和抗氧化失衡而引发的组织损伤。OS 不仅在慢性炎症、肿瘤、老化及各种代谢性疾病中发挥着重要作用，也与PCOS的发生发展密切相关［10］。有研究报道［11］，OS 损伤可导致卵泡发育受损、成熟障碍和卵泡闭锁；同时也有研究提出［12］，OS 可增强卵巢雄激素相关合成酶StAR 的表达，刺激雄性激素的产生和释放，从而导致PCOS 发生。这些研究提示OS 可能是PCOS 的发病机制之一，减轻OS 可能是PCOS 治疗的潜在方法。黄芪甲苷作为传统中药黄芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、扩血管和改善心脑缺血性疾病等作用［13］，但黄芪甲苷是否对PCOS 造成的氧化应激损伤以及性激素水平有一定的作用，尚未见报道。本研究结果显示，黄芪甲苷能通过下调PCOS大鼠机体的氧化应激水平，抑制StAR 的表达，调节血清性激素水平，减少卵巢组织细胞凋亡，从而发挥对PCOS模型大鼠的保护作用。

PCOS 是一种常见的排卵障碍性疾病，其卵泡发育异常主要表现为过多的早期卵泡生长。本研究结果显示，PCOS 模型大鼠动情周期紊乱，卵巢指数显著增加，卵巢组织形态学观察结果表明，模型大鼠卵巢内可见较多囊状扩张卵泡，未见黄体，提示无排卵，与临床PCOS 患者病理表现相符［14］，说明本研究成功建立了来曲唑诱导的PCOS大鼠模型，该模型的核心病理机制可能是由于卵泡不能发育成熟和卵泡壁的过度增生不能破裂，导致卵泡闭锁造成的。给与高剂量黄芪甲苷治疗后，模型大鼠动情周期恢复规律性变化，卵巢指数趋于正常，卵巢内少见囊状扩张卵泡，黄体有所恢复，提示黄芪甲苷能够显著改善PCOS 模型大鼠的排卵状况。正常生理状态下卵泡的生长发育在多种性激素的调控下精密有序地进行，包括T、LH、E2和FSH［15］。PCOS 患者通常表现出复杂的内分泌异常，其中以高血清T 和LH 以及低血清E2和FSH 为主要特征［16-17］。本研究结果显示，PCOS 大鼠血清T 和LH 含量显著增加，而E2和FSH含量显著减少，与前人研究一致。而给与高剂量黄芪甲苷治疗后，模型大鼠血清T 和LH 含量下降，E2和FSH 含量回升，说明黄芪甲苷能够显著平衡PCOS模型大鼠的血清激素水平。

表6 各组大鼠卵巢组织中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相对表达水平Table 6.Relative protein expression levels of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in rat ovarian tissue in each group（Meas±SD. n=12）

OS 被认为是PCOS 的潜在诱因，OS 能加重高雄激素的发生，而高雄激素血症被认为是PCOS的典型特征之一［18］。MDA 是脂质过氧化产物，可反映机体氧化损伤的程度；SOD 和GSH-Px 是两种主要的抗氧化剂，在维持机体的氧化-抗氧化动态平衡中起着重要作用，可将其作为抗氧化能力的检测指标。本研究结果显示，PCOS模型大鼠血清及卵巢组织中均出现MDA 含量明显升高，GSH-Px 和SOD 活性明显降低的现象，与Seyyed 等［19］的研究结果一致，表明OS确实参与PCOS 进程的调控。高剂量黄芪甲苷治疗后，PCOS 大鼠血清及卵巢组织中MDA 含量明显下调，GSH-Px 和SOD 活性明显上升，提示黄芪甲苷治疗能有效改善其氧化应激水平。卵泡颗粒细胞参与了卵巢卵泡的发育、成熟、闭锁及卵巢性激素的正常分泌过程，其凋亡被认为是PCOS卵泡退化的根本原因［20］。本研究结果显示，PCOS 模型大鼠卵巢组织中cleaved caspase-3 和Bax 蛋白水平显著上调，Bcl-2 蛋白显著下调，而高剂量黄芪甲苷治疗能逆转这类凋亡蛋白的表达变化，说明黄芪甲苷能减少卵巢细胞的凋亡，改善PCOS症状。为进一步明确黄芪甲苷改善PCOS氧化应激损伤的具体靶点，本研究对各组大鼠卵巢组织中StAR 蛋白表达水平进行了检测，研究结果显示，模型组大鼠卵巢组织中StAR 蛋白表达明显增加，高剂量黄芪甲苷处理后StAR 蛋白表达显著减少。提示黄芪甲苷可通过抑制OS发生，减少StAR的表达，调节性激素水平，从而改善PCOS。

综上所述，黄芪甲苷可通过发挥抗OS 功效，下调StAR 蛋白表达，调节血清性激素水平，缓解卵巢增生程度和病理改变，从而发挥对来曲唑致PCOS模型大鼠的保护和调节作用，为黄芪甲苷应用于治疗PCOS提供了实验基础。