欧阳颖，曾爱红，张羚枚，周瑞瑜，唐淑敏，阮扬皓，李伍凤

（中山大学孙逸仙纪念医院儿科，广东广州 510120）

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic en⁃cephalopathy，HIE）是新生儿窒息后的严重并发症，是引起智能落后、癫痫、共济失调和脑性瘫痪［1］的主要原因之一。据报道，近10年来HIE的发病率大约在（2～3）/1 000 例活产新生儿［2-3］。到目前为止，国内外对新生儿缺氧缺血性脑病的治疗，主要包括支持治疗和对症治疗，但均对已有的脑损伤无作用。因此，寻找更为有效的治疗方法成为当前急需解决的问题。

HIE 是围产期新生儿缺氧、缺血引起的脑部病变，在大多数情况下，缺氧和缺血同时发生，但缺血对中枢神经系统损伤更大。缺氧缺血性脑病发病机理极为复杂，现阶段普遍认为HIE 是代谢障碍、酸中毒、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙超载、氧化应激反应、炎症反应等一系列病理作用的结果［4-6］。因此，明确HIE 的发病机制、寻找高效且副作用少的治疗方法具有重要的意义。

丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）是丙酮酸的酯化物，是一种化学性能稳定、亲脂性的小分子化合物，能迅速穿过细胞膜和线粒体［7］。EP 的主要药理作用包括提供能量代谢物，保护细胞免受氧化产物和自由基的侵害，抑制炎症反应［8-11］。有报道称EP通过核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）/血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）通路激活内源性抗氧化系统［10］。此外，EP 还通过与P65［11］相互作用抑制NF-κB的活性，降低早期肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子的表达，下调［12］晚期HMGB1的合成和释放。因此，EP 有望通过逆转HIE 的病理过程，发挥更大的神经保护作用。研究EP 作用下体外培养新生大鼠颗粒神经元Nrf2/ARE/HO-1 信号通路的激活状态并探讨其机制，将为HIE未来临床治疗提供参考资料。

材料和方法

1 主要试剂

基础细胞培养液和新生小牛血清购自Gibco BRL；胰酶、脱氧核糖核酸酶、胰酶抑制剂、阿糖胞苷、核糖核酸酶、谷氨酸（glutamate，Glu）、多聚赖氨酸、二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）、碘化丙 啶（propidium iodide，PI）、Hoechst 33258、EP 和MK-801 均购自Sigma；硫酸庆大霉素购自福建三明制药厂；Triton X-100和氯仿购自Merck；饱和重蒸酚溶液购自中山大学医学院药理实验室；细胞核蛋白与细胞质蛋白提取试剂盒购自宁波唯奥公司；H2-DCF-DA 购自Invitrogen；抗Nrf2 和HO-1 抗体购自Stressgen；MTT 购自Sigma-Aldrich；二氢乙啶（dihy⁃droethidium，DHE）和4%多聚甲醛购自Sigma。

2 小脑颗粒神经元培养

按文献方法［13］，取新生7 d 的Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不拘，在无菌条件下断头、开颅，取小脑，放在解剖液［10×Krebs 缓冲液（NaCl 72.5 g，KCl 4.0 g，NaH2PO41.4 g，右旋糖26 g，苯酚红100 mg，EP 59.6 g/L，pH 7.4）15 mL，白蛋白0.45 g，3.82%MgSO41.2 mL，pH 7.4］中，显微镜下去除血管和脑膜。然后用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块，胰酶（0.25 g/L）消化（37℃，15 min），立即加反应终止液I（含胰酶抑制剂0.52 g/L、DNase-I 0.08 mg/L和Mg2+3 mmol/L 的解剖液）混匀、离心、弃上层，沉淀加反应终止液II（含Mg2+3 mmol/L 和Ca2+100 μmol/L 的解剖液）2 mL 反复吹打，离心（319×g，30 s），去除未消化的组织，细胞悬液再离心（958×g，5 min），弃上层，细胞沉淀以完全培养液（BME，25 mmol/L KCl，谷氨酰胺20 mmol/L，10%胎牛血清，0.1 g/L 硫酸庆大霉素）分散，按（1.5～1.8）×109/L 种植在预先铺有多聚赖氨酸（5 mg/L）的培养板或培养皿中，细胞数为（2～3）×106/cm2。然后置于CO2培养箱中（37℃，5% CO2）培养。24 h 后，加阿糖胞苷（终浓度为10 μmol/L）。7 d 后，加葡萄糖（终浓度为5 mmol/L）。以后每隔4 d 按前法加一次葡萄糖。7 d后，神经元分化成熟。

3 Glu兴奋性模型建立与实验分组

将体外培养7 d 的小脑颗粒神经元随机分为：（1）空白对照（control）组；（2）Glu 组［参考文献［13］，弃去培养液，加入Locke 溶液（含154 mmol/L NaCl，5.6 mmol/L KCl，3.6 mmol/L NaHCO3，2.3 mmol/L CaCl2，5.6 mmol/L glucose，10 mmol/L HEPES，pH 7.4）和1 mol/L 甘氨酸，以充分激活NMDA 敏感的Glu 识别位点，Glu 浓度为100 μmol/L，30 min 后换成普通的完全培养液］；（3）Glu+EP 组［在（2）组基础上加入不同浓度（0.1、0.5、1、2.5 和5 mmol/L）的EP。每组有8个复孔。

4 主要方法

4.1 FDA/PI 荧光染色 用FDA 和PI 分别对活细胞和死细胞进行染色。将待处理的细胞，弃培养液后，以含糖的PBS 洗1 遍，加入FDA（10 mg/L）和PI（4 mg/L），于暗室37℃孵育5 min，弃染液后以含糖的PBS 洗2 遍，荧光显微镜下拍照，每组随机选3 个视野拍照。与正常对照组比较，计算存活率。细胞存活率（%）=各处理组的活细胞数/正常对照组的活细胞数×100%。

4.2 MTT 实验 取培养7 d 的小脑颗粒细胞，在给药相应时间后，加入新鲜配制的MTT（溶于PBS，5 g/L）20 μL，将细胞置于含5%CO2、37℃的培养箱中孵育4～6 h后去除培养液，加入二甲基亚砜溶解结晶体，待结晶体完全溶解后，在酶标仪上（测定波长570 nm，参考波长630 nm）测吸光度（A），细胞存活率（%）=A处理组/A对照组×100%。

4.3 细胞内游离钙浓度（intracellular free calcium concentration，［Ca2+］i）的测定 用培养第7 d 的细胞，经5 μmol/L的Fluo-3/AM负载60 min，用Hanks液洗涤3次，放在倒置荧光显微镜下，由自动灌洗仪持续灌流缓冲液。应用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Fluo-3 的荧光强度（激发波长488 nm，发射波长526 nm），每组选取20个活细胞，每个细胞间隔2 s扫描1 次，共扫描16 次，记录16 个荧光强度数值，取平均值为该细胞的荧光强度。根据公式计算：［Ca2+］i=Kd（F−Fmin）/（Fmax−F），Kd为Fluo3 与Ca2+反应的解离常数，在室温下为400 nmol/L；F 为实验记录到的荧光强度值；Fmax为最大荧光值，加入5 mmol/L CaCl2的EGTA 溶液所测得的值；Fmin为最小荧光值，由在无Ca2+缓冲液中加入10 mmol/L EGTA测得。

4.4 H2-DCF-DA 检测 ROS 在Glu 模型作用后90 min，弃去培养液，使用PBS 清洗3 次后，加入终浓度为30 μmol/L 的H2-DCF-DA，在37℃培养箱中孵育20 min，用PBS清洗1次，迅速置于荧光酶标仪检测荧光强度，激发及吸收波长采用475 nm/525 nm。

4.5 DHE 检测超氧阴离子 在Glu 模型作用后90 min，弃去培养液，使用PBS 清洗3 次后，加入终浓度为10 μmol/L 的DHE，在37℃培养箱中孵育30 min，用PBS清洗1次，迅速置于多功能荧光酶标仪检测荧光强度，激发及吸收波长采用485 nm/535 nm。

4.6 Western blot 根据试剂盒说明，提取细胞核蛋白与细胞质蛋白，于−80℃保存，后与DTT 混合、煮沸、离心，使蛋白质变性，取上清20 μL 于200 V 进行SDS-PAGE 45 min；取出硝酸纤维膜，浸入TBS+TBST+5%脱脂奶粉溶液，室温封闭2 h，在10 mL I 抗稀释液中把NC 膜和I抗共同轻摇孵育，4℃过夜。第2天，用1×TBST 洗NC 膜3次（每次15 mL，5 min），把NC 膜与溶解在10 mL 封闭液中的与HRP 结合的Ⅱ抗（适当比例稀释）和HRP 结合的抗生物素抗体（1∶1 000）室温下共同孵育1 h；用1×TBST 洗NC 膜3 次（每次15 mL，5 min），与10 mL 1× LumiGLO（含0.5 mL 20×底物B和9.0 mL水）室温下轻摇1 min。排去过量的液体，在暗室中使其与X 光片在增感屏中紧密接触，使X 光片感光数秒到数分钟。显影，定影，冲洗，晾干，拍照并进行计算机图像分析。

4.7 免疫组化 细胞用PBS 溶液洗2 次，后用4%多聚甲醛固定在室温下30 min。然后再用PBS 洗2次，通过0.5% Triton X-100 在室温下孵化15 min。10%的细胞封锁在山羊血清，室温1 h。4℃孵育过夜。PBS 洗涤3 次，室温下用稀释的荧光抗体孵育1.5 h。室温下用Hoechst 33258 染色细胞核15 min，PBS洗涤3次后，激光共聚焦显微镜成像。

4.8 ARE诱导转录活性检测 用Promega公司双萤光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度。所有的程序都是按照制造商的指示进行的。pGL6-ARE-Luc 质粒是基于pGL6 载体构建，ARE 序列为3 个串联的CACCGTGACTCAGCAATT，并在我们的实验中进行。诱导转录活性增加倍数=（药物诱导的萤火虫萤光素酶活性/药物诱导的海肾萤光素酶活性）/（对照组诱导的萤火虫萤光素酶活性/对照组诱导的海肾萤光素酶活性）。

5 统计学处理

用SPSS 16.0 统计软件进行分析。以上实验均重复3次，数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.3.1 加强电力需求侧管理。在现有用户负荷管理范围内，选取部分可中断负荷，建设毫秒级精准负荷控制系统，优化升级现有负荷管理系统。应用大数据平台，试点对用户用电行为开展实时分析，进一步挖掘其在用电预测、错峰调度等方面潜力，促进供需互动。

结 果

1 EP对小脑颗粒神经元的保护作用

如图1 所示，EP 对原代培养神经元Glu 兴奋性毒性的抑制作用呈剂量依赖性。100 μmol/L Glu 对原代培养的小脑颗粒神经元有明显的损伤作用，表现为细胞数量减少，细胞体积异常，轴突/树突断裂和消失。FDA/PI双染色下可见正常组绝大部分细胞染成绿色，夹杂着少许红染的细胞，Glu 组则绿染细胞减少，而红色的死细胞明显增多。1 mmol/L EP 预处理30 min 后，Glu 诱导损伤下存活神经元数量显著增加（P＜0.05），EP以浓度依赖性的方式显著提高了神经元的活力。

2 细胞内ROS检测结果

我们通过H2-DCF-DA 检测小脑颗粒神经元的ROS 含量，用DHE 检测超氧阴离子含量。H2-DCFDA 染色后，含ROS 的细胞发绿色荧光，ROS 越多，荧光强度越大。与正常对照组少量的绿色荧光细胞相比，Glu 组可见到绿色荧光细胞明显增多，荧光强度大；而Glu+EP 组则绿色荧光细胞明显减少，荧光强度明显减弱，见图2。DHE 染色后，含超氧阴离子的细胞与DHE 作用而发出红色荧光，超氧阴离子越多，荧光强度越大。与正常对照组少量红色荧光细胞相比，Glu 组可见红色荧光细胞明显增多，荧光强度增大；而Glu+EP 组则红色荧光细胞明显减少，荧光强度较弱，见图2。

3 小脑颗粒神经元［Ca2+］i检测结果

我们通过Fluo-3 作为指标检测细胞内Ca2+。在小脑颗粒神经元中，加入Glu，动态观察［Ca2+］i水平，20 s 即可观察到荧光强度迅速升高，达到高峰，随时间延长逐渐降低，但6 min 时仍显著高于正常；加入EP（2.5 和5.0 mmol/L）预处理30 min 可以部分阻滞［Ca2+］i升高（P＜0.05），见图3。

4 EP通过激活Nrf2/ARE/HO-1通路发挥神经保护作用

通过检测EP 处理神经元中Nrf-2 的表达，观察到EP 组中细胞质Nrf2 表达下降，细胞核Nrf2 表达明显上调，见图4A。之后，在Nrf2 免疫组化染色后加入Hoechst 染色，在激光共聚焦显微镜下观察，正常对照组细胞浆染成红色，核染成蓝色，而EP 组中细胞质染成红色，细胞核内因Nrf2明显升高，核亦染成红色，同时在Hoechst 染色后呈蓝色，融合后核呈红色，提示Nrf2 转入核内，见图4B。在检测ARE 的转录活性实验中，EP 组ARE 的转录活性显著上调（P＜0.05），见图4C。如图4D 所示，Glu 或EP 处理3 h、6 h 和12 h 均显著提高HO-1 的表达水平（P＜0.05），且Glu 和EP 共处理进一步增加了HO-1 的表达。相反，HO-1 抑制剂锌原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）部分抑制了EP的神经保护作用，见图4E。

讨 论

1 Glu对体外培养小脑颗粒神经元的毒性作用

本实验中，小脑颗粒神经元在Glu作用后24 h存活率为（28.4±2.1）%，与文献结果相符［14］。DNA 电泳未出现梯形条带，呈涂布状，提示主要的死亡方式为坏死。另一研究［15］的结果则不同，在没有甘氨酸存在及无镁离子的Locke 液的情况下，Glu 的毒性浓度选择为300 μmol/L，但细胞存活率仍高于本实验模型。因此，同样为Glu模型，浓度不同，处理方式不同，细胞死亡的方式不同，Glu 引起细胞死亡所激活的通路可能不同。

2 EP对小脑颗粒神经元的保护作用

EP 具有组织能量守恒、抗炎、抗氧化等药理作用［16］，可减轻体内的全身炎症反应和多脏器功能障碍［17］。有研究称EP 可以治疗重症急性胰腺炎（se⁃vere acute pancreatitis，SAP），减轻SAP 相关的远端器官损伤，如肝、肺和肾［18-19］。此外，EP 能减轻外伤性脑损伤和出血性脑损伤［20］。

在本研究中，EP在浓度0.1～5 mmol/L时剂量依赖性地抑制Glu 的兴奋性毒性作用，充分说明EP 具有神经保护作用，可能为一种在中枢神经系统疾病中有应用前景的药物。

3 细胞内ROS检测结果

4 EP抑制细胞内钙升高

Figure 1.Protective effect of ethyl pyruvate（EP）on rat cerebellar granule neurons.A-1：normal cerebellar granule neurons，scale bar=40 μm；A-2：cerebellar granule neurons treated with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 24 h，scale bar=40 μm；A-3：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，scale bar=40 μm；A-4：normal cer⁃ebellar granule neurons，FDA staining，scale bar=10 μm；A-5：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，FDA staining，scale bar=10 μm；A-6：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，FDA staining，scale bar=10 μm；A-7：normal cerebellar granule neurons，PI staining，scale bar=20 μm；A-8：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm；A-9：cerebellar granule neurons treated with Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）for 24 h，PI staining，scale bar=20 μm.B：the effect of EP（0.1～5 mmol/L）on the viability of Glu（100 μmol/L）-induced cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Glu group.图1 丙酮酸乙酯对大鼠小脑颗粒神经元的保护作用

正常情况下，细胞内的钙浓度为100 nmol/L，比细胞外的钙低10 000倍。细胞间隙高浓度的Glu，可引起N-甲基-D 天冬氨酸受体过度兴奋，Ca2+大量内流，［Ca2+］i短暂升高；经过一段时间之后，出现第2次钙离子升高，称之为延迟性钙失调，为不可逆损伤，导致细胞死亡。［Ca2+］i过高可聚集在线粒体内，损伤氧化磷酸化通道，造成ATP 不足；另一方面，Ca2+与钙调素形成复合物，激活多种蛋白酶，引起广泛的信号传导分子磷酸化，而产生各种细胞效应；同时促进氧自由基产生，故细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后通路［22］。

Figure 2.Detection of ROS in rat cerebellar granule neurons.A：control group，H2-DCF-DA staining；B：glutamate（Glu；100 μmol/L）group，H2-DCF-DA staining；C：Glu（100 μmol/L）+ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）group，H2-DCF-DA stain⁃ing；D：control group，DHE staining；E：Glu（100 μmol/L）group，DHE staining；F：Glu（100 μmol/L）+EP（2.5 mmol/L）group，DHE staining.Scale bar=50 μm.图2 大鼠小脑颗粒神经元内ROS检测结果

Figure 3.Detection of［Ca2+］i in rat cerebellar granule neurons.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group.图3 大鼠小脑颗粒神经元［Ca2+］i检测结果

本实验中，Glu 组细胞内钙在20 s 左右迅速升高，持续6 min 以上。而EP+Glu 组细胞内钙较正常组升高，但显著低于Glu组，提示EP通过抑制细胞内钙离子浓度升高，阻断了引起神经元损伤的上游通路。因此，抑制［Ca2+］i的升高在EP 的神经保护作用中起到很重要的作用。

5 EP 通过激活Nrf2/ARE 通路而发挥神经保护作用

Nrf2-ARE信号通路被认为是一种新型的抗氧化信号通路，以Nrf2为核心，激活一些保护性的酶的产生，如HO-1、超氧化物歧化酶及还原型谷胱甘肽；HO-1 及还原型谷胱甘肽可抑制细胞凋亡，抗氧化，缓解细胞内钙离子超载［23］。在颅脑外伤、颅内出血和脑缺血梗死动物模型中均有Nrf2-ARE 信号通路激活。有研究显示，移植Nrf2 过度表达的星形胶质细胞至纹状体可减轻丙二酸诱导的细胞损害［24］；应用小干扰RNA 降低Nrf2 的表达，可引起NO 诱导的神经细胞瘤细胞的凋亡增多［25］。

本实验结果显示，在EP 处理组，Nrf2 转运入核中，12 h 核内Nrf2 仍升高。免疫组化染色显示核内Nrf2 明显增多，ARE 介导的荧光素酶转录活性升高，提示EP 激活Nrf2/ARE 通路，使ARE 转录活性增高。同时，Glu 引起HO-1 升高，证明Glu 的氧化性损伤也可引起HO-1 升高，但12 h 即下降，说明Glu 激发的HO-1 升高所起到的保护作用有限，而EP 可引起正常小脑颗粒细胞内HO-1升高，与Glu一起，协同诱导HO-1升高，可发挥较强的抗氧化损伤作用。ZnPP部分阻滞EP 的保护作用，则说明HO-1 的保护作用是确切的。因此，EP 是通过激活Nrf2/ARE/HO-1 通路而起到保护作用。

综上所述，我们的研究为EP 在体外对大鼠小脑颗粒神经元Glu 兴奋性神经毒性的保护作用提供了实验依据。EP 的作用机制包括抗氧化、减轻脑水肿、抑制细胞凋亡，而在HIE 发病过程中，Glu 兴奋性毒性是脑损伤的主要环节，因此我们推断EP 可能在HIE神经保护治疗方面具有广阔的应用前景。

Figure 4.The expression of Nrf2/ARE/HO-1 pathway-related proteins in rat cerebellar granule neurons.A：ethyl pyruvate（EP；2.5 mmol/L）decreased cytoplasmic Nrf2，but increased nuclear Nrf2；B：cytoplasmic Nrf2 was translocated into the nucleus after treatment with 2.5 mmol/L EP for 6 and 12 h（scale bar=20 μm）；C：EP elevated the relative luciferase activity in⁃duced by ARE；D-1：the expression of HO-1 after treatment with 100 μmol/L glutamate（Glu）for 0，3，6，12 and 24 h；D-2：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP for 0，3，6 and 12 h；D-3：the expression of HO-1 after treatment with 2.5 mmol/L EP+100 μmol/L Glu for 1，3 and 6 h；E：ZnPP partly inhibited the protective effect of EP against Glu excitotoxicity.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Glu group；△P＜0.05 vs Glu+EP group.图4 大鼠小脑颗粒神经元内Nrf2/ARE/HO-1通路相关蛋白表达的检测结果