冯 瑞 洪鹏志 杨 萍 周春霞

(1. 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2. 广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；3. 广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江 524088；4. 南方海洋科学与工程广东省实验室〔湛江〕，广东 湛江 524025)

肌球蛋白是肌肉蛋白的主要功能成分，占鱼肉肌原纤维蛋白的55%～60%[1]，经热处理可以形成凝胶，在鱼糜制品加工中起关键作用[2]。肌球蛋白凝胶形成过程涉及蛋白质分子的展开、聚集和交联，最终通过增强蛋白质分子间相互作用形成稳定的三维网络结构，从而决定产品的持水性和质构特性[3]。而肌球蛋白是盐溶性蛋白，在体外低盐(<0.2 mol/L NaCl)溶液中容易自发聚集成纤丝[4-5]，热诱导肌球蛋白分子无法有效解离/展开，由纤丝之间的相互作用形成聚集体，凝胶特性较差[6]。凝胶制作通常需2%～3%的盐溶解肌球蛋白，促进蛋白质分子展开，增加分子间相互作用，诱导凝胶网络结构的形成[7]，因此，鱼糜制品生产过程中需添加一定量的食盐(NaCl)来保证产品的安全性，还可以改善其质地和风味。而膳食中过量摄入钠会导致血压升高，增加心血管和肾脏疾病的风险[8]。

目前，常见的改善低钠条件下鱼糜制品凝胶性的方法有：使用与NaCl相似的其他氯化盐作为替代品，或使用蛋白质、水化胶体、转谷氨酰胺酶等凝胶增强剂[9-11]。研究[12-14]表明，二价阳离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+等)通过与蛋白质分子带负电的羧基之间的盐桥作用，诱导蛋白质的交联，改善鱼糜凝胶的功能特性，其效果与离子类型和浓度有关。Ca2+是霍夫迈斯特序列中使蛋白质不稳定的阳离子[15]，会促进蛋白质的展开，增强热处理过程中相邻蛋白质分子间疏水相互作用和二硫交联，进一步促进钙桥的形成，从而改变其凝胶性能[16-18]。此外，Ca2+也可能激活内源性转谷氨酰胺酶的活性，催化特定的酰基转移反应，通过ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸交联形成更强的鱼糜凝胶网络[19]。经Ca2+诱导展开的肌球蛋白再进行适当的高压处理(<300 MPa)会导致分子进一步展开，增强分子间共价和非共价相互作用，形成致密有序的肌球蛋白凝胶网络结构，但强的高压处理(500 MPa)会导致肌球蛋白过度变性，破坏蛋白质与水的相互作用[20]。

试验拟以罗非鱼肌球蛋白为研究对象，在几种典型盐浓度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)下，考察CaCl2添加量对肌球蛋白热诱导凝胶持水性和微观结构的影响，探讨适量钙离子对低盐肌球蛋白凝胶性能的改善及机理，为新型低盐水产蛋白凝胶制品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活罗非鱼：取其背部白肉、分装、-75 ℃贮藏备用，市售；

氯化钾、六水合氯化镁、硫酸铵、乙二胺四乙酸二钠：分析纯，广州化学试剂厂；

5-腺苷三磷酸二钠盐(ATP)、二硫苏糖醇(DTT)、马来酸：广州齐云生物科技有限公司；

乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；

快速Lowry法蛋白含量测定试剂盒：上海荔达生物科技有限公司；

无水氯化钙：分析纯，广州市金华大化学试剂有限公司；

β-巯基乙醇：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

高速冷冻离心机：Avanti J-26sxp型，美国贝克曼公司；

紫外分光光度计：Cary 60型，安捷伦科技(中国)有限公司；

恒温水浴锅：TU-20HT型，英国比比科技有限公司；

傅里叶红外光谱仪：TENSOR27型，德国布鲁克公司；

扫描电子显微镜：JEM-7610-F型，日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.2 肌球蛋白溶液及其热诱导凝胶的制备 将提取的肌球蛋白溶液分成4组，分别用不同盐浓度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)的磷酸盐缓冲液(20 mmol/L Na2HPO4—NaH2PO4，pH 7.0)透析24 h(4 ℃)，采用Lowry法试剂盒检测其蛋白含量，并用对应盐浓度的透析液调节至蛋白浓度为20 mg/mL，即为各离子强度下的肌球蛋白溶液。取上述肌球蛋白溶液20 mL，加入10 mmol/L CaCl2，水浴升温(20～80 ℃，1 ℃/min)处理，80 ℃保温30 min，迅速冷却，4 ℃保存过夜，48 h内使用。以不添加CaCl2的肌球蛋白体系为对照组。

1.3.3 浊度的测定 将1.3.2透析后的各肌球蛋白溶液稀释至1.0 mg/mL，加入10 mmol/L CaCl2，以不添加CaCl2的肌球蛋白体系为对照组。水浴升温处理(20～80 ℃，1 ℃/min)，每隔10 ℃取样，参照Hemung等[17]的方法进行浊度的检测。

1.3.4 凝胶持水性的检测 参照文献[18]。

1.3.5 扫描电子显微镜(SEM)观察 取制备好的凝胶样品用刀片切成1 mm厚度的小片，采用戊二醛溶液固定、磷酸盐缓冲液洗涤，然后依次进行乙醇脱水、叔丁醇置换、冷冻干燥和喷金[11]，加速电压8 kV下放大10 000倍观察。

1.3.6 凝胶化学作用力的测定 参照Hwang等[22]的四段溶解法并稍作修改。其4种溶液分别为0.6 mol/L NaCl(S1)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(S2)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(S3)、0.5 mol/Lβ-巯基乙醇+0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(S4)。取制备好的肌球蛋白凝胶样品2 g，加入20 mL S1，5 000 r/min匀浆2 min，4 ℃放置1 h，10 000 r/min离心25 min，上清液V1于4 ℃保存，所得沉淀1加入20 mL S2，匀浆、静置、离心处理得上清液V2和沉淀2，沉淀中加入20 mL S3，同上处理得上清液V3和沉淀3，沉淀中加入20 mL S4，同上处理后得上清液V4。上述各步离心所得上清液分别加入等体积的20%三氯乙酸溶液，10 000 r/min离心15 min，去上清液，沉淀分别用2 mL NaOH溶液(1 mol/L)溶解，采用Lowry试剂盒测定其蛋白质含量。离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键的贡献分别用溶解于S1、S2、S3、S4的蛋白含量与匀浆的蛋白含量的比值表示。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱测定及二级结构分析 将凝胶样品冷冻干燥后粉碎，称取约1 mg的样品与溴化钾混合压片，较低空气湿度下收集红外光谱(4 000～400 cm-1)，分辨率4 cm-1。使用OMNIC 7.3和Peakfit Version 4.12软件对酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)图谱进行基线校正、平滑、去卷积处理，并通过Gaussian曲线拟合，得到肌球蛋白凝胶样品的二级结构含量[23]。

1.4 统计分析

所有试验重复3次，使用SPSS 22软件进行方差分析(ANOVA)，并通过Duncan的多范围检验显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 CaCl2对热处理过程中肌球蛋白体系浊度的影响

由图1可知，肌球蛋白体系的浊度随盐浓度的增大逐渐下降(P<0.05)。低离子强度(1，50 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白溶解性差，体系明显浑浊[24]，随着升温处理的进行，浊度持续增加(P<0.05)，且升温至40 ℃时浊度增加已非常明显，体系热稳定性差。生理离子强度(150 mmol/L NaCl)下，未经热处理的肌球蛋白溶液已基本澄清，当处理温度≥40 ℃时，溶液明显变得浑浊，且变化比50 mmol/L NaCl下的聚集更明显。这表明生理离子强度下部分解离的肌球蛋白分子比低离子强度下的纤丝结构更容易展开和变性，大量疏水基团暴露导致分子间通过疏水相互作用聚集。当NaCl浓度为600 mmol/L时，肌球蛋白溶解，分子以单体或寡聚物形式存在，体系澄清透明，且在升温处理过程中溶液保持澄清，肌球蛋白分子展开和聚集达到平衡，肌球蛋白重链头部聚合，分子聚集不明显。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

添加CaCl2后，不同盐浓度下肌球蛋白体系浊度增加(P<0.05)，且热处理过程中浊度增大尤为明显(P<0.05)，表明适量CaCl2对肌球蛋白体系有较好的交联聚集效果，可能与Ca2+存在下肌球蛋白分子间的盐桥作用及不同盐浓度下分子的热变性聚集有关。低盐浓度(1，150 mmol/L)下，热处理升温至40 ℃时，肌球蛋白结构伸展并开始变性聚集，Ca2+的盐桥作用导致分子间热聚集增强，继续升温至80 ℃时，变性的肌球蛋白由于分子间共价和非共价相互作用进一步聚集，体系浊度继续增大(P<0.05)。高盐浓度(600 mmol/L)下，热诱导肌球蛋白单体分子展开的速度大于聚集速度，Ca2+诱导肌球蛋白聚集不明显，与低浓度CaCl2对鱼肌球蛋白溶液浊度的影响类似[17]。

2.2 CaCl2对肌球蛋白凝胶持水性的影响

由图2可知，随着盐浓度的增加，肌球蛋白热凝胶形成能力增强，持水性增加(P<0.05)，透明度增大，表明不同盐浓度下形成的凝胶三维网络结构以及分子聚集方式和聚集体的大小可能不同。低离子强度(1，50 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白溶解性差，热处理过程中分子不能充分展开和相互作用，分子表面疏水性增加不明显[25]，纤丝迅速聚集形成大的颗粒聚集体，此时持水性极差，热诱导肌球蛋白体系呈不透明弱凝胶，具有较强的流动性。随着离子强度的增加，解离的肌球蛋白分子与水分子的相互作用增强，肌球蛋白溶解性增大，受热后其结构更容易展开，分子表面疏水性增加，体系的热凝胶形成能力增强。当NaCl浓度为150 mmol/L时，体系可以形成硬凝胶，透明度增加，持水性>60%。当NaCl浓度为600 mmol/L时，低温热处理导致肌球蛋白重链头部聚合，总巯基含量下降，在高温条件下肌球蛋白尾部有序聚集，形成规则的网络结构，截留水分的能力增强，此时持水性达94.23%。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

添加CaCl2后，不同离子强度下肌球蛋白热诱导凝胶的持水性显著增大(P<0.05)，表明Ca2+的添加有利于蛋白质分子的展开和(或)聚集，肌球蛋白分子间相互作用增强，且低盐条件下改善尤为明显。当NaCl浓度为1 mmol/L时，添加CaCl2后肌球蛋白凝胶的持水性提高了26%；当NaCl浓度为150 mmol/L时，添加CaCl2后肌球蛋白凝胶的白度增加，肉眼观察即可识别出凝胶色差的变化；当NaCl浓度为600 mmol/L 时，添加CaCl2后肌球蛋白凝胶的持水性达98%。添加CaCl2后不同离子强度下肌球蛋白热诱导形成不透明凝胶，表明Ca2+存在时肌球蛋白分子聚集的速度大于展开的速度[26-27]。低盐条件下，Ca2+存在导致纤丝的肌球蛋白分子部分展开和分子间紧密聚集，分子间通过强的相互作用形成不透明凝胶，硬度较大[28]；高盐条件下，肌球蛋白分子充分展开，高温时的Ca2+诱导肌球蛋白尾部有序聚集，凝胶透明度下降，白度和持水性增加。因此，适量添加CaCl2能明显改善凝胶的持水性。

2.3 CaCl2对肌球蛋白凝胶微观结构的影响

由图3可知，当NaCl浓度为1～150 mmol/L时，肌球蛋白溶解度差，热诱导肌球蛋白纤丝快速聚集形成粗糙的交联链，凝胶微观结构孔径较大，呈现清晰而不规则的网络结构，对水分子的截留能力差[29]，其中50 mmol/L NaCl下的凝胶网络孔径最大，与浊度结果一致；当NaCl浓度为600 mmol/L时，肌球蛋白分子充分展开并有序聚集，热诱导凝胶呈固态结构，表面平滑均匀，但仍存在较大的孔洞，与纯的鱼肌球蛋白热凝胶微观结构类似[30]。添加CaCl2后，不同盐浓度下肌球蛋白热诱导凝胶微观结构显示清晰的紧密交叉连接，细腻均匀的网络结构形成，凝胶孔径极小，因此凝胶的持水性和白度增加，且1，150 mmol/L NaCl下的凝胶微观结构改善尤为明显，进一步表明适量添加Ca2+能诱导肌球蛋白分子展开和变性。

2.4 CaCl2对肌球蛋白凝胶化学作用力的影响

由图4可知，0.6 mol/L NaCl—8 mol/L尿素溶液(S3)中肌球蛋白凝胶溶解度最高(P<0.05)，其次为二硫键，离子键和氢键所占比例较小，表明分子间疏水相互作用和二硫键是维持肌球蛋白热诱导凝胶的主要化学作用力。低盐浓度(1～150 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白热诱导凝胶二硫键比例随盐浓度的增加显著升高(P<0.05)，主要是由于盐离子的作用加快了肌球蛋白分子结构的部分展开，热诱导分子内部疏水基团和巯基逐渐暴露，分子间疏水相互作用增强，分子明显聚集；随着热处理温度的升高，巯基氧化成二硫键，导致不可逆的凝胶网络结构形成。高盐浓度(600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白呈单体，α-螺旋含量较高，相应的热凝胶中离子键和氢键含量高，二硫键含量降低，体系呈透明软凝胶，弹性模量和凝胶硬度下降，与微观结构结果基本一致。添加CaCl2后，肌球蛋白热凝胶的主要化学作用力仍为疏水相互作用和二硫交联，但二硫键所占比例明显升高(P<0.05)，疏水相互作用比例下降(P<0.05)，离子键和氢键所占比例降低，且1 mmol/L NaCl下的二硫键含量增加最明显。因此，适量添加Ca2+能促进热处理过程中肌球蛋白分子结构及化学作用力的变化，其改进效果与凝胶持水性和微观结构一致。

图3 CaCl2对罗非鱼肌球蛋白热诱导凝胶扫描电镜图的影响

S1. 离子键 S2. 氢键 S3. 疏水相互作用 S4. 二硫键

2.5 肌球蛋白二级结构的变化分析

研究[31]表明，α-螺旋是鱼糜蛋白质的主要构象，鱼糜凝胶中肌球蛋白的α-螺旋结构部分转化为β-折叠、β-转角和无规卷曲结构，其中β-折叠和无规卷曲结构是维持鱼糜凝胶的主要蛋白质构象，且β-折叠结构对凝胶强度的贡献最大。由图5可知，肌球蛋白分子包含棒状尾部和球状头部，棒状尾部由α-螺旋构成。未经热处理的肌球蛋白分子以α-螺旋结构为主，且随盐浓度的增加(1～600 mmol/L NaCl)肌球蛋白α-螺旋含量增加。添加CaCl2后，凝胶中肌球蛋白α-螺旋结构含量降低，而β-折叠和无规卷曲结构含量增大，且低盐条件下变化更加明显。1 mmol/L NaCl条件下添加CaCl2后，凝胶肌球蛋白α-螺旋比例从17.51%下降到13.72%，β-折叠比例从31.06%增加到36.70%，表明CaCl2的作用有利于低盐条件下肌球蛋白凝胶的形成，与Ca2+诱导肌球蛋白凝胶二级结构的变化结果类似[17]。因此，适量添加CaCl2可诱导热处理过程中肌球蛋白分子结构展开，α-螺旋结构转化成β-折叠结构，分子间相互作用增强，明显改善低盐条件下肌球蛋白凝胶的网络结构及持水性。

3 结论

试验表明，不同盐浓度(1，50，150，600 mmol/L NaCl)下，肌球蛋白热诱导凝胶的微观结构和持水性能存在差异。但适量添加Ca2+可诱导不同盐浓度下肌球蛋白分子部分展开和变性，热处理过程中更多的疏水基团和交联位点暴露，肌球蛋白分子α-螺旋结构部分转化成β-折叠结构，进一步促进钙桥及分子间疏水相互作用和二硫键的形成，肌球蛋白分子有序交联形成致密均匀的三维凝胶网络结构，凝胶持水性显著提高(P<0.05)，且低盐条件下改善更明显。

1～8分别为1 mmol/L NaCl、1 mmol/L NaCl + CaCl2、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaCl + CaCl2、150 mmol/L NaCl、150 mmol/L NaCl + CaCl2、600 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl + CaCl2

图5 CaCl2对热诱导凝胶中肌球蛋白二级结构的影响

Figure 5 Effect of CaCl2addition on the secondary structure of myosin in heat-induced gel