魏长浩 邓泽元 范亚苇邹新华 李 静 李红艳

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047； 2. 播恩生物技术股份有限公司，江西 赣州 341000)

研究[1]表明，从江西本土发酵豆渣食品中分离筛选得到的粗壮脉纹孢菌(Neurosporacrassa)具有较强的产酶能力，且孢子中富含类胡萝卜素，利用粗壮脉纹孢菌对农副产品进行固态发酵，可以很大限度地降低其抗营养因子含量。此外，利用粗壮脉纹孢菌的产酶体系，还可以分解农副产品中的纤维和蛋白质等，产生糖类、肽段以及氨基酸等生物活性物质，提高农副产品的营养价值[2-4]。

豆渣作为大豆加工的副产物，富含膳食纤维、蛋白质等营养物质，但口感不佳、豆腥味浓且易腐败变质等[5]。叶俊等[6]研究发现，利用粗壮脉纹孢菌发酵豆渣能有效降低豆渣中的粗纤维含量，并且发酵后的豆渣中粗蛋白、粗纤维、可溶性总糖等营养物质含量均有显著提高。Vong等[7]发现，利用解脂耶罗威亚酵母发酵豆渣不仅能提高豆渣的营养水平，还可生成谷氨酸盐等鲜味物质。Vidiany等[8]使用酿酒酵母对豆渣进行发酵能有效促进总酚含量的增加和异黄酮的生物转化，提高了豆渣的抗氧化性能。因此，利用微生物发酵豆渣不仅可以将底物中大分子物质转化为小分子物质，还可通过微生物自身的生理生化反应产生新的营养成分和生物活性物质，提高豆渣的营养价值和保健功能。

试验拟在粗壮脉纹孢菌发酵豆渣的最佳产蛋白酶条件下，对不同发酵时间的豆渣多肽、总酚、总黄酮含量和抗氧化性进行研究，为粗壮脉纹孢菌发酵农副产物生产抗氧化肽提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种及原材料

粗壮脉纹孢菌CGMCC NO.3088：实验室保藏；

豆渣：市售；

没食子酸、芦丁、谷胱甘肽(还原型)标准品：阿拉丁试剂(上海)有限公司；

DPPH标准品、FRAP试剂盒(BC1315)：上海索莱宝生物科技有限公司；

福林酚：分析纯，上海索莱宝生科技有限公司；

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；

6×上样缓冲液：北京全式金生物技术有限公司；

邻苯三酚标准品：美国Sigma公司；

硫酸亚铁、硫酸铜、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：分析纯，西陇科学股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

恒温恒湿箱：HPX-160BSH型，上海新苗医疗器械制造有限公司；

电热鼓风干燥器：DGG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司；

电子天平：FA1104型，上海精天电子仪器厂；

桌上型超净工作台：HD-650型，苏州安泰空气技术有限公司；

立式压力蒸汽灭菌锅：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

全自动酶标仪：ELX800型，美国 BioTek 公司；

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 斜面培养 将粗壮脉纹孢菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的固体斜面上，于30 ℃，湿度70%的恒温恒湿培养箱中，光照条件下培养96 h，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 将活化好的菌种转移到PDA固体培养基中，于30 ℃，湿度70%的恒温恒湿培养箱中，光照条件下培养96 h，收集孢子制成孢子悬液。

1.2.3 固态发酵豆渣 称取10 g豆渣为固态发酵培养基的基质物质，参照于新颖[9]的方法进行固态发酵108 h，每间隔12 h取样，将样品冻干并粉碎备用。

1.2.4 SDS-PAGE电泳 称取样品0.05 g，加入1 mL水，涡旋混匀，4 ℃，10 000 r/min离心5 min，取上清液，并与6×上样缓冲液按比例混合，沸水浴10 min，冷却，取15 μL样液进行上样。浓缩胶电泳输出电压80 V，分离胶电泳输出电压120 V。按表1的方法配置浓缩胶与分离胶。

表1 SDS-PAGE电泳制胶组成成分

1.2.5 多肽含量的测定 参照涂宗财等[10-11]的方法并修改。准确称取不同发酵时间的冻干豆渣样品1 g，加入10 mL蒸馏水，涡旋提取，4 500 r/min离心10 min，取1 mL上清液与1 mL 10%三氯乙酸混合，充分摇匀后静置1～2 min，4 500 r/min离心10 min。取1.5 mL上清液并加入1.5 mL 5%三氯乙酸和2 mL双缩脲试剂，充分混匀后静置反应10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定540 nm处吸光值，以3 mL 5%的三氯乙酸与2 mL双缩脲混合溶液为空白对照，按式(1)计算多肽含量。

(1)

式中：

C——多肽含量，mg/g；

X——查标准曲线值，mg/mL；

V——提取所用蒸馏水体积，mL；

W——提取所用样品质量，g；

N——提取液稀释倍数。

1.2.6 多肽提取液的制备 参照陈洁梅等[12]的方法提取豆渣水溶性蛋白，并过0.45 μm微孔滤膜去除不溶物和细菌，4 ℃冷藏备用。

1.2.7 总酚含量的测定 采用福林酚试剂法[13]并修改。取一定量的发酵豆渣提取液，冻干后用等量的70%乙醇复溶，4 500 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入2 mL 0.2 mol/L福林酚溶液，混匀后静置5 min，再加入3 mL 10%的碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25 mL，避光反应60 min，测定760 nm处吸光值，按式(2)计算总酚含量。

(2)

式中：

C——活性物质含量，mg/g；

X——查标准曲线值，mg/mL；

V——提取所用蒸馏水体积，mL；

W——提取所用样品质量，g。

1.2.8 总黄酮含量的测定 采用亚硝酸钠—硝酸铝法[14]并修改。取一定量的发酵豆渣提取液，冻干后用等量的70%乙醇复溶，4 500 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入0.4 mL 5%的亚硝酸钠溶液，混匀后静置6 min，再加入0.4 mL 10%的硝酸铝溶液，用70%乙醇定容至10 mL，避光反应15 min，测定510 nm处吸光值，按式(2)计算总黄酮含量。

1.2.9 总抗氧化能力的测定 参照FRAP试剂盒说明书，通过测定铁离子还原能力评价不同发酵时间豆渣的总抗氧化能力。按式(3)计算总抗氧化能力。

(3)

式中：

C——总抗氧化能力，μmol/g；

X——硫酸亚铁浓度，μmol/mL；

V1——提取所用蒸馏水体积，mL；

W——提取所用样品质量，g；

V2——反应液总体积，μL；

V3——反应中样品体积，μL。

1.2.10 超氧阴离子自由基清除率的测定 参照文献[15]。

1.2.11 DPPH自由基清除率的测定 参照Torres-Fuentes等[16]的方法并修改。取2 mL样品溶液，加入等量的95%乙醇溶液(含0.2 mmol/L DPPH)，混匀；以95%的乙醇与DPPH混合溶液为空白组；95%的乙醇溶液代替DPPH与样品混合为对照组，避光反应30 min，测定517 nm处吸光值，按式(4)计算DPPH自由基清除率。

(4)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

As——样品吸光值；

Ab——空白组吸光值；

Ac——对照组吸光值。

1.3 数据处理

使用Origin 2017软件制图，用SPSS 19软件进行显著性(P<0.05)及相关性分析，结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳

由图1可知，发酵后的豆渣存在许多原料豆渣中没有的蛋白条带，说明这些蛋白是粗壮脉纹孢菌菌体为满足自身代谢需求所合成的。随着发酵时间的延长，11 kDa左右的条带颜色逐步加深，说明粗壮脉纹孢菌可以通过自身酶系生成小分子物质，并逐渐积累。刘慧菊等[17]研究发现，利用微生物发酵处理脱脂蚕豆能有效提高原料中粗蛋白、可溶性蛋白以及多肽含量。

M. 标准蛋白 1. 豆渣原料 2. 发酵12 h 3. 发酵24 h 4. 发酵36 h 5. 发酵48 h 6. 发酵60 h 7. 发酵72 h 8. 发酵84 h9. 发酵96 h 10. 发酵108 h

图1 发酵不同时间豆渣的SDS-PAGE图

Figure 1 SDS-PAGE profiles of soybean dregs at different fermentation time

2.2 豆渣的多肽含量

由图2可知，经粗壮脉纹孢菌发酵的豆渣多肽含量与未经发酵的豆渣存在显著性差异(P<0.05)，且随发酵时间的增加而上升。当发酵时间为84 h时，豆渣中多肽含量达最大，为(75.602±3.599) mg/g，是未发酵豆渣的5倍，说明利用粗壮脉纹孢菌发酵处理豆渣能很好地降解豆渣中的大分子蛋白并将其转化为小分子多肽。孙林等[18]研究发现，发酵后的菜籽粕多肽含量是未经发酵的7倍左右。发酵84 h后多肽含量出现下降，可能是因为继续发酵会产生一些能降解肽的酶类[19]。

2.3 豆渣的总酚、总黄酮含量

由图3可知，经粗壮脉纹孢菌发酵的豆渣总酚、总黄酮含量与未经发酵的豆渣存在显著性差异(P<0.05)。当发酵时间为60 h时，豆渣中总酚、总黄酮含量达最大，分别为(2.513±0.032)，(0.787±0.052) mg/g，是未发酵豆渣的13，15倍。宋莹等[20]研究发现，经过发酵的紫薯生粉其总酚和总黄酮含量均有显著提高。这可能是由于微生物发酵使得结合型酚类物质与黄酮物质被释放，使得游离酚类化合物与黄酮类化合物含量显著提高[14,21]。研究[22]表明，微生物可通过自身酶系合成黄酮类物质或者改善合成途径的方式提高基质中的黄酮含量。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

Figure 2 Peptide contents of soybean dregs at different fermentation time

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4 豆渣的抗氧化能力及其相关性

由图4可知，经粗壮脉纹孢菌发酵的豆渣总抗氧化能力、超氧阴离子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均显著高于未经发酵的豆渣(P<0.05)，三者的最高值均出现在发酵84 h时，分别为(31.651±0.191) μmol/g，(35.537±1.408)%，(70.131±0.552)%，说明发酵可以很好地提高底物的抗氧化活性。Lee等[23]研究发现，冻融豆腐在发酵18 h时最理想，其还原糖、总肽、异黄酮含量、抗氧化活性均有较大提高。

由表2可知，总酚、总黄酮以及多肽含量均与抗氧化能力极显著相关(P<0.01)。总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力中，相关性最高的为多肽含量，其次是总酚含量；超氧阴离子自由基清除能力中总酚含量的相关性最高，其次是多肽含量。Moayedi等[24]研究发现，氨基酸和多肽的浓度与抗氧化和抗菌活性之间呈良好的相关性。综上，多肽含量的升高是抗氧化能力提升的关键因素，粗壮脉纹孢菌发酵豆渣会产生抗氧化多肽，且最佳发酵时间为84 h。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

表2发酵豆渣中多肽、总酚及总黄酮含量与抗氧化能力的相关性†

Table 2 Correlation between the content of peptides,total phenols,total flavone and antioxidant capacity of fermented soybean dregs

指标多肽含量总酚含量总黄酮含量总抗氧化能力超氧阴离子自由基清除能力DPPH自由基清除能力多肽含量1.000总酚含量0.952**1.000总黄酮含量0.762**0.846**1.000总抗氧化能力0.947**0.938**0.794**1.000超氧阴离子自由基清除能力0.963**0.974**0.817**0.976**1.000DPPH自由基清除能力0.969**0.956**0.787**0.991**0.989**1.000

† **表示差异极显著(P<0.01)。

3 结论

以粗壮脉纹孢菌作为发酵菌种，对其固态发酵豆渣抗氧化性质进行了探索。结果表明，利用粗壮脉纹孢菌对豆渣进行发酵可以很好地利用豆渣中的大分子蛋白，并将其降解为多肽，发酵过程中可释放处于结合状态的多酚、黄酮等活性物质，提高豆渣的利用价值。多肽含量与抗氧化能力最为相关，且当发酵时间为84 h时，多肽含量、总抗氧化能力、超氧阴离子自由基清除率、DPPH自由基清除率均达最高。试验仅对多肽混合液进行了研究，后续将在此基础上通过对抗氧化肽的分离纯化以及鉴定对抗氧化肽进行深入研究。