高谋 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏匀 姚慧 杨志军

目前，颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）仍是严重影响发达国家和发展中国家患者生活质量的主要神经系统疾病[1,2]。研究发现TBI后炎症反应可加重神经细胞损伤，是造成TBI后神经功能障碍的重要原因之一[3-5]。值得注意的是TBI后补体系统激活在中枢神经系统（central nervous system,CNS）炎症反应中发挥了关键作用，并且补体活化水平与脑损伤程度密切相关[6-8]。例如，补体活化产物可参与TBI后继发性脑损伤，加重神经细胞损伤，延缓神经功能恢复[9,10]。近来，随着对干细胞移植治疗CNS疾病研究的深入，干细胞不仅可在神经修复与再生方面发挥作用，而且干细胞生物学行为与补体系统也有着重要联系[11-14]。笔者曾报道经静脉移植诱导型神经干细胞 （induced neural stem cells，iNSCs）可抑制TBI后补体活化，减少了补体活化产物C3d和C5b-9沉积于神经细胞上，从而减轻了补体活化引起的继发性脑损伤[15,16]。此外，笔者发现用TBI小鼠血清处理iNSCs，可上调其补体调节因子Crry的表达量[15,16]。为进一步研究TBI小鼠血清处理iNSCs对其移植调控TBI后补体活化的作用，本研究分别用TBI小鼠血清、热灭活TBI小鼠血清或磷酸盐缓冲液 （phosphate buffered solution，PBS）预处理 iNSCs， 并将 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs经立体定向移植到TBI小鼠脑内，观察脑组织中补体活化产物（C3d和 C9）、补体调节因子Crry和细胞凋亡标记物active Caspase-3等蛋白表达水平，以及脑组织内NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞的分布情况，以探讨TBI动物血清预处理iNSCs立体定向移植对TBI后补体活化的影响，现报道如下。

材料与方法

一、实验动物

健康成年雄性C57BL/6小鼠54只，8～10周龄，体质量24～30 g，所有实验动物（无特定病原体级）均购自北京维通利华公司。

二、主要实验仪器和试剂

仪器：CO2细胞培养箱（Thermo公司，美国），超净工作台 （ESCO公司，美国），倒置相差显微镜、CM1950冰冻切片机、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦显微镜和DM3000荧光显微镜（Leica公司，德国），微量电动组织匀浆器（IKA公司，德国），电泳仪、电泳槽、转膜仪和Gel Doc XR System凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司，美国）。

试剂：DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、B27、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase酶、左旋谷酰胺和磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美国），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma公司，美国），BCA试剂盒 （Thermo公司，美国），C3d 抗体 （工作浓度：5 μg/mL）（R&D Systems公司，美国），C9 抗体（工作浓度：1 μg/mL）和 active Caspase-3 抗体（工作浓度：1 μg/mL）（Abcam 公司，美国），Crry 抗体（工作浓度：5 μg/mL）（BD Biosciences公司， 美国），GAPDH 抗体 （工作浓度：0.2 μg/mL）（Santa Cruz公司，美国），HRP标记兔抗山羊IgG抗体（工作浓度：0.08 μg/mL）、HRP 标记山羊抗兔 IgG抗体（工作浓度：0.08 μg/mL）和HRP标记山羊抗大鼠 IgG 抗体 （工作浓度：0.08 μg/mL）（ZSGB-BIO 公司，中国），NeuN 抗体（工作浓度：5 μg/mL）（Millipore公司，美国），Alexa Fluor®633标记山羊抗小鼠NeuN 抗体（工作浓度：2 μg/mL）（Life Tech 公司，美国 ），4’,6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚 （4’,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Southern Biotech 公司， 美国），原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Roche公司，德国）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs体外培养

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12与Neurobasal等体积混合培养基培养。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制备

用异氟烷气体麻醉剂麻醉小鼠，并将其固定于脑立体定向仪上，备皮消毒，铺无菌洞巾，切开皮肤，暴露前囟，以lambda缝向喙侧2.0 mm、中线偏右侧2.0 mm为撞击点。用自由落体脑打击装置，撞针直径3.0 mm，制备 TBI模型。 设置假手术（sham）组（6只），仅切开头皮，不实施撞击。于伤后1 h对TBI小鼠进行神经功能缺损评分（neurological severity scores，NSS），将 NSS 为 4～8 分者（48 只）纳入 TBI组。

五、预处理iNSCs和细胞移植

按照随机数字表法选取24只TBI小鼠用于制备TBI小鼠血清和热灭活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制备iNSCs单细胞悬液，用PBS漂洗后离心弃去上清，用500 μL的TBI小鼠血清、热灭活TBI小鼠血清或PBS重悬细胞，接种于24孔板（细胞密度为 1×106个/孔），置于 37℃培养箱中处理45 min。收集细胞悬液，用PBS漂洗3遍，用台盼蓝染色法计数活细胞，用PBS重悬细胞并调整细胞密度。余下24只TBI小鼠于伤后12 h，用脑立体定向仪按照随机数字表法将5 μL含1×106个TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs单细胞悬液分别移植到小鼠脑内：TBI-iNSCs移植组 （6只）、HITBI-iNSCs移植组（6 只）和 PBS-iNSCs移植组（6 只），另设对照（Control）组（6 只）。

六、Western blot

于TBI后14 d，麻醉动物后处死，收集各组新鲜脑组织。用电子分析天平量取脑组织，用微量电动组织匀浆器匀浆，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，行Western blot检测各组脑组织中 C3d、C9、Crry 和active Caspase-3蛋白的表达水平。用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制胶，取30～40 μg蛋白样品，电泳分离后转至PVDF膜，用含有5%BSA的TBS封闭1～2 h 后，分别加入 C3d 抗体（工作浓度：5 μg/mL）、C9抗体（工作浓度：1 μg/mL）、Crry 抗体（工作浓度：5 μg/mL）、active Caspase-3 抗体（工作浓度：1 μg/mL）和 GAPDH 抗体（工作浓度：0.2 μg/mL）在 4℃孵育过夜。用PBS漂洗后，分别加入HRP标记兔抗山羊IgG 抗体（工作浓度：0.08 μg/mL）、HRP 标记山羊抗兔IgG抗体（工作浓度：0.08 μg/mL）和HRP标记山羊抗大鼠 IgG 抗体（工作浓度：0.08 μg/mL），室温反应2～3 h。用PBS漂洗后，在暗室内用ECL显色剂显色并使用Gel Doc XR System凝胶成像分析系统曝光。 计算 C3d/GAPDH、C9/GAPDH、Crry/GAPDH和active Caspase-3/GAPDH蛋白的相对表达量。

七、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色和TUNEL染色

于TBI后14 d，取各组相同部位小鼠脑组织经固定后，行冰冻切片，切片厚度为10 μm。行免疫荧光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封闭1 h后，加入 NeuN 抗体（工作浓度：5 μg/mL）在 4℃孵育过夜。用PBS漂洗后，加入Alexa Fluor®633标记山羊抗小鼠NeuN抗体（工作浓度：2 μg/mL）室温避光孵育2 h。用PBS漂洗后，行TUNEL染色，并用DAPI染细胞核，封片后，在荧光显微镜下观察，在20×镜下随机选取6个视野，计数阳性细胞数（特异性抗体标记）和总细胞数（DAPI标记），计算阳性细胞百分率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

八、统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。小鼠脑组织中 C3d/GAPDH、C9/GAPDH、Crry/GAPDH 和active Caspase-3/GAPDH蛋白的相对表达量，以及NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞的数量以均数±标准差（±s）表示，资料先进行正态性检验和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TBI小鼠血清预处理iNSCs移植物影响C3d、C9、Crry和 active Caspase-3蛋白的表达水平

在TBI后14 d，取各组动物脑组织行Western blot检测，经统计分析发现：相比Sham组，PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组、TBI-iNSCs组和 Control组C3d、C9和active Caspase-3表达水平明显增高，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）；而与Control组相比，PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组和 TBI-iNSCs组C3d、C9和active Caspase-3表达水平明显降低（P＜0.05）；与 PBS-iNSCs组和 HITBI-iNSCs组相比，TBI-iNSCs组C3d、C9和active Caspase-3表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

此外，相比Sham 组，PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组和TBI-iNSCs组 Crry表达水平明显增高 （P＜0.05）； 相比 Control组，PBS-iNSCs组、HITBI-iNSCs组、TBI-iNSCs组和Sham组Crry表达水平明显增高，组间差异具有统计学意义 （P＜0.05）；与PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组相比，TBI-iNSCs组Crry表达水平明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

二、TBI小鼠血清预处理iNSCs移植物减少NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞

在TBI后14 d，3组TBI小鼠脑组织中均可见NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞（图1）。3组NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞所占比分别为：PBS-iNSCs组（14.84%±1.60%）、HITBI-iNSCs组（13.52%±1.36%）及 TBI-iNSCs组（7.61%±0.76%）。经统计分析发现，PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组的NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。然而，与 PBS-iNSCs组和HITBI-iNSCs组比较，TBI-iNSCs组NeuN抗体阳性和TUNEL阳性的细胞数量明显减少，组间比较差异有统计学意义（F=53.535，P＜0.05）。

表1 颅脑创伤14 d后的各组小鼠脑内C3d、C9、Crry和active Caspase-3蛋白的表达水平（±s）

与 Sham 组比较，aP＜0.05；与 Control组比较，bP＜0.05；与 TBI-iNSCs组比较，cP＜0.05；

A c t i v e C a s p a s e-3/G A P D H蛋白相对表达量S h a m 组 6 0.0 2±0.0 1 0.4 2±0.0 4 0.7 2±0.0 7 0.3 2±0.0 3 C o n t r o l组 6 1.4 5±0.1 2 a 1.5 1±0.1 4 a 0.3 6±0.0 2 a 1.5 7±0.1 4 a T B I-i N S C s组 6 0.6 2±0.0 7 ab 0.6 0±0.0 5 ab 1.5 0±0.1 3 ab 0.5 9±0.0 5 ab H I T B I-i N S C s组 6 0.9 4±0.1 0 abc 1.0 5±0.1 0 abc 0.9 5±0.0 8 abc 0.9 2±0.0 8 abc P B S-i N S C s组 6 1.0 0±0.0 9 abc 1.0 0±0.0 9 abc 1.0 0±0.0 8 abc 1.0 0±0.0 9 abc F值 2 3 4.6 3 5 1 3 3.0 5 6 1 4 8.9 3 8 1 8 8.6 0 8 P值 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0组别 只数 C 3 d/G A P D H蛋白相对表达量C 9/G A P D H蛋白相对表达量C r r y/G A P D H蛋白相对表达量

讨 论

近来研究认为补体系统是大脑发育的重要参与者，例如补体 C3、C3a、C3aR、C5a和 C5aR 对神经发生具有积极的调节作用[14,17]。然而，补体系统过度活化可加剧TBI后CNS炎症反应和继发性脑损伤[14,18]。此外，越来越多的证据表明补体系统过度活化可产生大量补体因子，不利于神经环路稳定性的维持，并与多种神经精神疾病密切相关[19,20]。由此可见，有效调控TBI后补体活化不仅可减轻补体介导的脑损伤，而且有利于TBI后神经功能重塑，促进患者神经功能恢复[21]。本课题组曾报道经静脉移植iNSCs可抑制TBI后补体活化，减少了补体活化产物C3d和C5b-9沉积于神经细胞上，从而减轻了补体活化引起的脑组织损伤[16]。为深入研究iNSCs移植调控TBI后补体活化的作用，笔者在前期实验发现TBI小鼠血清处理iNSCs，可上调其Crry表达量的基础上，进一步探讨经TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植对TBI后补体活化的影响[16]。结果显示TBI动物脑组织中补体活化产物C3d和C9较Sham组明显增高，并且细胞凋亡标记物active Caspase-3的表达水平也明显高于Sham组，这些数据再次证明了TBI后补体活化引起了继发性脑损伤。值得注意的是，接受 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs移植物的小鼠脑组织中C3d、C9和active Caspase-3的表达量均明显低于Control组，说明iNSCs立体定向移植可发挥抑制TBI后补体活化，减轻脑组织损伤等作用。此外，接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠脑内C3d、C9和active Caspase-3的表达量无明显差异，而接受TBI-iNSCs移植物小鼠脑内C3d、C9和active Caspase-3的表达量明显低于HITBI-iNSCs组和PBS-iNSCs组，说明TBI小鼠血清预处理iNSCs可明显增强其抑制TBI后补体活化参与的脑损伤的作用。

图1 3组小鼠颅脑创伤14 d后的脑组织免疫荧光染色和TUNEL染色检测（×400）

为探讨iNSCs立体定向移植调控TBI后补体活化的作用机制，本研究检测了各组动物脑内补体调节因子Crry的表达水平，结果发现TBI可明显减少脑内Crry的表达量，然而接受 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或PBS-iNSCs移植物的小鼠脑组织中Crry的表达量明显高于Control组，说明iNSCs立体定向移植可增加TBI动物脑内Crry表达量从而发挥抑制TBI后补体活化的作用。除此之外，接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠脑内Crry的表达量无明显差异，而接受TBI-iNSCs移植物小鼠脑内Crry的表达水平明显高于HITBI-iNSCs组和PBS-iNSCs组，说明TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植可明显上调TBI动物脑内Crry的表达量。随后，本研究检测了各组动物脑组织中NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞的分布情况，结果发现接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠脑内NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞的数量无明显差异，然而接受TBI-iNSCs移植物小鼠脑内NeuN抗体阳性和TUNEL阳性细胞数量明显低于HITBI-iNSCs组和PBS-iNSCs组，说明TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植可明显抑制TBI后补体活化引起的脑组织损伤。

综上所述，TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植可上调TBI小鼠脑内Crry水平，抑制补体活化，减轻脑损伤。通过对比前期研究中所采用的经静脉移植iNSCs，笔者认识到立体定向移植可更加精准地将iNSCs靶向输送到达脑损伤区，并同样发挥调控TBI后补体活化和减轻继发性脑损伤等作用。需要注意的是TBI后全身多个器官内均可检测到补体活化产物介导的病理损伤，而经静脉移植iNSCs可减少TBI后全身多个器官内补体活化产物的表达量，进而减轻组织病理损伤[15]。因此，后续研究笔者将重点关注：经TBI小鼠血清预处理iNSCs立体定向移植在调控TBI动物脑内补体活化的基础上对全身多个器官补体活化水平的影响。