隋轶 张尧 徐冰

【摘要】 目的 本研究拟探讨趋化因子受体CCR3在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中对于tau蛋白病理的介导作用， 以及对于其认知功能障碍的影响。方法 采用野生型同窝（WT）、CCR3-/-、APP/PS1及APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠， 应用蛋白印迹实验检测磷酸化tau蛋白以及磷酸化tau蛋白激酶水平;应用Morris水迷宫检测小鼠空间记忆缺陷。结果 APP/PS1双转基因小鼠中的CCR3缺陷减少了tau过度磷酸化和tau激酶的活化， 同时改善了APP/PS1双转基因小鼠的空间记忆缺陷（P<0.05， one-way ANOVA）。结论 CCR3缺乏可以通过减少tau蛋白激酶的活化以及tau过度磷酸化而促进APP/PS1小鼠的空间记忆缺陷的改善。CCR3可能成为治疗AD的潜在药物靶点。

【关键词】 阿尔茨海默病;tau蛋白磷酸化;趋化因子;CCR3

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.05.111

AD患者脑内的tau蛋白过度磷酸化， 神经原纤维缠结， 以及神经元和突触的丧失与认知功能障碍密切相关[1]。针对tau蛋白病理， 而不是β淀粉样蛋白的临床治疗方法可能会更有效。tau是一种高度可溶的， 天然未折叠的微管相关蛋白， 主要集中在轴突中并与微管结合， 从而稳定其结构。通过微管相关蛋白Tau（MAPT）基因的替代mRNA剪接在成年人脑中表达了6种tau同型异构体， 所有这些都已在AD相关病变中检测到。在涉及tau的所有疾病中， 过度磷酸化的tau不能与微管相互作用， 因此破坏了轴浆流动。AD的特征在于脑中存在高水平的过度磷酸化tau神经元内包涵体。实际上， tau过度磷酸化可能促进其自组装成配对的螺旋丝和直丝， 并形成神经纤维缠结。在带有可溶性tau聚集体的神经元死亡之后， tau细丝可以存在于细胞外空间中;将这些可溶性低聚物转化为不溶性丝状tau沉积物是其病理的关键步骤， 其构成了潜在的治疗靶点。CCL11是可能参与AD病理学的一种重要趋化因子。CCL11在衰老过程中已被证明在血清中逐渐升高， 其年龄依赖性增加与海马依赖性学习和记忆任务的缺陷相关。上述这些与老化相关的变化可以通过脑室内注射重组CCL11进行重复， 并且可以通过全身或脑室内给予CCL11的中和抗体来预防 [2]。因此， CCL11很可能是影响海马功能的关键因素， 并与AD有密切关联。CCL11与一种由星形胶质细胞， 小胶质细胞和神经元表达的趋化因子受体， CCR3结合 [3]。本研究证明受体CCR3的缺乏通过减少CCL11导致的tau过度磷酸化和tau激酶的活化， 从而挽救了APP/PS1双转基因小鼠的空间记忆缺陷。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 CCR3-/-和APP/PS1双转基因小鼠[B6C3-Tg表达嵌合小鼠/人APP（Mo/HuAPP695swe）]和突变型人PS1（PS1-dE9）蛋白小鼠购自The Jackson Laboratory。将这些小鼠与C57BL/6种系回交至少8代。获得CCR3基因缺陷小鼠（APP/PS1/CCR3-/-）， 将杂合的APP/PS1小鼠连续与CCR3-/-小鼠杂交， 随后进行交叉。

1. 2 蛋白质印迹分析 将细胞或脑组织在含有蛋白酶抑制剂混合物的TBS（20 mM Tris-HCl缓冲液， pH 7.4， 150 mM NaCl）中匀浆， 包括0.5 mM苯甲基磺酰氟， 20 μg/ml抑肽酶， 20 μg/ml 亮抑酶肽， 20 μg/ml 胃蛋白酶抑制剂和1 mM EDTA。将匀浆物短暂超声处理并以15000×g离心30 min。在还原条件下， 将样品（每泳道10 μg蛋白质）在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.1% Tween 20， 3%干乳的TBS封闭膜1 h， 然后在室温下用特异性抗体孵育2 h。洗涤后， 将印迹与相应的HRP标记的第二抗体（1∶1000稀释）一起温育1 h。使用ECL系统检测标记。使用光密度测定软件分析条带。

1. 3 Morris水迷宫测试 高龄APP/PS1双转基因小鼠发生AD样认知缺陷 [4]。在APP/PS1小鼠中， 验证CCR3缺乏是否可以挽救AD小鼠的学习和记忆缺陷的假设。为此， 进行了Morris水迷宫测试， 用于比较APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠的学习和记忆任务（12个月大）和它们的同窝小鼠。使用Morris水迷宫测试12个月大的WT、CCR3-/-、APP/PS1和APP/PS1/CCR3-/-小鼠。將小鼠以准随机方式放入水中， 并允许其在120 s内搜索平台。一旦到达平台， 允许小鼠在其上保持10 s。如果小鼠在120 s内未能找到平台， 则实验者会协助它在同一时间内站在平台上。试验后， 将小鼠取出， 干燥并置于单独的笼中约60 min直至下一次试验。对小鼠进行连续5 d， 4次/d试验的训练， 并记录它们的空间学习分数（以秒为单位， 找到平台）。在最后一次训练（第5天）后24 h进行的空间探针试验中， 移除平台并使小鼠自由游泳90 s， 并记录其在目标象限中花费的时间。所有运动都由计算机化跟踪系统记录。

1. 4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用单因素方差分析， 然后进行Fisher最不显著差异事后分析， 以确定显著的效果。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 APP/PS1双转基因小鼠中的CCR3缺陷降低tau过度磷酸化和tau激酶的活化 与WT小鼠相比， APP/PS1双转基因小鼠的海马组织中多个部位的tau蛋白过度磷酸化显著增加， 均与包括ERK1/2、CDK5和GSK3β的tau激酶的显著激活有关（P<0.05， one-way ANOVA）。同时， 与APP/PS1双转基因小鼠相比， APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠表现出tau的过度磷酸化、tau激酶活性显著降低（P<0.05， one-way ANOVA）。

2. 2 CCR3 缺陷挽救了APP/PS1雙转基因小鼠的空间记忆缺陷 APP/PS1小鼠表现出使用可用的视觉空间线索来定位水下逃生平台的学习能力受损;APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠在该任务中表现出显著改善的学习能力（P<0.05， one-way ANOVA）。

3 讨论

趋化因子在衰老期间的血清中水平升高， 并且在AD脑中的神经炎症过程中由活化的神经胶质细胞产生， 因此它在神经变性疾病中的作用正在引起越来越多的关注。在本研究中， 证明了在APP/PS1双转基因小鼠中， CCL11受体CCR3的缺乏显著降低了tau蛋白过度磷酸化和tau蛋白激酶如ERK1/2、CDK5和GSK3β的活化， 这同时与小鼠的学习和记忆改善有关。因此， CCR3介导的趋化因子CCL11的神经炎症作用可能直接参与AD发病机制。

在AD患者的大脑中， tau异常过度磷酸化， 并且在这种改变的状态下， 它聚集成成对的螺旋状细丝， 形成神经原纤维缠结。据推测， 不同部位的tau 蛋白过度磷酸化对其生物学功能及其致病作用有不同的影响。而在Ser262、Thr231和Ser23位点的 tau过度磷酸化抑制其与微管的结合， 在Ser199/Ser202/Thr205、Thr212、Thr231/Ser235、Ser262/Ser356和Ser422位点的超磷酸化使tau转换成为一种抑制正常微管相关蛋白的抑制分子。趋化因子似乎是涉及tau病理学的重要因素。例如， CXCL1 通过CXCR2（CXCL1 受体）介导的ERK1/2激活触发原代神经元培养物中的tau蛋白过度磷酸化。现在， 本研究提供证据证明CCL11/CCR3在tau蛋白过度磷酸化中发挥作用。同时， CCR3缺乏逆转了APP/PS1双转基因小鼠脑中CDK5和GSK3β磷酸化的增加。本研究确定了CCL11/CCR3 导致tau 过度磷酸化的途径。

本研究的行为学研究发现CCR3缺陷挽救了APP/PS1小鼠空间记忆缺陷。尽管在APP/PS1双转基因小鼠中观察到的减弱的突触损失和改善的空间学习能力可以归因于减轻的Aβ产生和神经炎症， 这两者在AD中均有助于突触损失和认知缺陷的发生， 但是基于本研究中CCR3缺乏所致tau蛋白过度磷酸化和tau激酶活化减少的研究结果， 本研究提出CCL11/CCR3在APP/PS1小鼠空间记忆缺陷改善中起直接作用。

综上所述， 本研究的发现支持这样的假设：CCR3缺乏可以通过减少tau蛋白激酶的活化以及tau过度磷酸化而促进APP/PS1小鼠的空间记忆缺陷的改善。

参考文献

[1] Mattson MP. Pathways Towards and Away from Alzheimers Disease. Nature， 2016， 430（7000）：631-639.

[2] Villeda SA， Luo J， Mosher KI， et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature， 477（7362）：90-94.

[3] He J， Chen Y， Farzan M， et al. CCR3 and CCR5 are co-receptors for HIV-1 infection of microglia. Nature （London）， 1997， 385（6617）：645-649.

[4] Ding Y， Qiao A， Wang Z， et al. Retinoic Acid Attenuates ？-Amyloid Deposition and Rescues Memory Deficits in an Alzheimer＼"s Disease Transgenic Mouse Model. Journal of Neuroscience， 2008， 28（45）：11622-11634.

[收稿日期：2018-11-12]