倪梦霞，王玮，郑爱燕，丁洁，邢丽贤，刘敏娟，毛君，蒲艳，邹琴燕，孟庆霞，李红，偶健*，张癸荣*

(1.南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院生殖与遗传中心，苏州 215002；2. 北京市中科遗传与生殖医学研究院，北京 100026)

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种以脊髓前角运动神经元退化变性为特征的常染色体隐性遗传病，常见的临床特征为对称性、进行性的肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩和瘫痪[1-2]，其发病率约为1/6 000～1/10 000[3]，具有典型的临床异质性。目前，国际上根据SMA的临床表现，共将其分为4种亚型。Ⅰ型(Werdnig-Hoffman病)即严重型，出生6个月之内发病，患者不能坐立，通常2岁前死亡。Ⅱ型即中间型，出生6～18个月内发病，患者可以坐但无法站立亦无独立行走能力，伴有关节挛缩和脊柱后突，寿命超过2岁，具体存活年龄通常视呼吸系统并发症而定。Ⅲ型(Kugelburg-Welander 病)，出生18个月后发病，患者可独立行走，但行走无力，伴有脊柱侧突和骨质疏松，可存活至成年。Ⅳ型即成年型，发病年龄为15～60岁，35岁是高发年龄，患者可能出现行走困难，无消化系统和呼吸系统症状，存活时间与正常人无异[2，4]。除这几种类型外，还有一种不常见的类型，称为 SMA 0 型，这种类型发生在宫内，表现为明显的胎动减少，若不及时采取措施，可于1岁内死亡。SMA患者主要的致病基因是运动神经元存活(SMN)基因，该基因编码的蛋白是一种跨物种蛋白，生物信息学研究显示该蛋白高度保守，且在身体各部位均有表达，其在脊髓运动神经元中表达量最高[5-8]。

本研究收集了1个SMA家系的临床资料，采用Real-time PCR法检测SMN1基因exon7 拷贝数，结合二代测序(NGS)及单体型连锁分析为该家系提供遗传咨询，并为携带者夫妇进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)。

资料和方法

一、研究对象

2013年3月一对表型正常夫妇携带先证者于苏州市立医院生殖与遗传中心进行遗传咨询。经体格检查，发现先证者可以坐但无法站立亦无法正常行走，同时伴有关节挛缩及脊柱后突，被确诊为SMA患者。经家系调查后，明确该夫妇生育过3次，其中1例为先证者，1例已死亡，另生育1健康女孩夭折。2014年至2016年另妊娠3次，于孕中期在本院行产前诊断均为SMA患儿，均引产(图1)。2017年该夫妇要求行PGD再生育，签署知情同意后在本院进行PGD。

图1 家系图

二、研究方法

1.SMN1基因检测：收集先证者及其父母的EDTA-K2抗凝外周血样本，采用TIANGEN试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。针对SMN1基因exon7设计特异性引物，引物 5′端分别用FAM和 HEX荧光基团标记，上游引物序列为：5′-CCTTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3′；下游引物序列为：5′-GATTGTTTTACATTAACCTTTCAACTTTT-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。随后采用常州百代生物科技有限公司的Super MultiProbe Kit试剂盒进行Real-time PCR，分析实验结果。

2.PGD策略：SMA PGD可使用单细胞全基因组扩增试剂盒(Sureplex，BlueGenome，英国)进行单细胞全基因组扩增(WGA)。利用该家系建立单体型，采取家系中收集的外周血样本证实Sureplex WGA试剂盒可以有效扩增目标单核苷酸多态(SNP)位点和致病变异所在位置，证实全基因组扩增成功。这一家系将在通过单体型实验验证后进入PGD程序。可先对所有胚胎进行单体型连锁分析和Sanger测序，不携带致病变异的胚胎再进行染色体拷贝数分析。

3.PGD流程：根据南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心制定的常规促排卵方案，取卵后进行卵胞浆内单精子注射(ICSI)人工授精。培养5～6 d后，将形成的4枚囊胚，按本中心常规操作流程行胚胎活检，取5～8个滋养层细胞进行全基因组扩增[9]。

4.单体型连锁分析：以SMN1基因(28 Kb)的exon7的70247773位点为目标区域，并在该基因的上游3M区域内选择51个及下游2M区域选择56个高密度紧密连锁的SNP作为遗传标记，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER网站设计引物，经DNA纯化、建库和NGS后，选择若干有效位点进行单体型分析。

5.全基因组低覆盖度测序：取120 ng Sureplex全基因组扩增产物，对其进行酶切打断，后经连接、纯化、文库扩增和低覆盖度测序(0.03X)，利用生物信息学方法对24条染色体进行拷贝数分析。

结 果

一、SMN1基因检测结果

先证者及其父母于苏州市立医院进行抽血检测，Real-time PCR法检测发现先证者父母的SMN1基因7号外显子为单拷贝，而先证者(患儿1)为SMN1基因的7号外显子纯合缺失；胎儿1为行PGD后植入胚胎发育的胎儿，拷贝数正常；胎儿2～4为自然妊娠行产前诊断的羊水样本，均为SMN1基因的7号外显子纯合缺失；胎儿5为生育的正常女孩，拷贝数正常(图2)。

图2 SMN1基因检测结果

二、单体型连锁分析结果

确定家系的致病原因后，以基因SMN1的exon7为目标区域，在该基因及基因的上下游选择高密度紧密连锁的SNP作为遗传标记，NGS后选择若干有效位点进行单体型分析。

三、NGS PGD结果

通过单体型连锁分析之后进行单基因病PGD周期，形成4枚囊胚(胚胎1～4)，经检测发现：未携带突变的整倍体囊胚1枚，单拷贝携带的整倍体囊胚1枚，单拷贝携带但为非整倍体囊胚1枚，致病的整倍体囊胚1枚(表1，表2)。将未致病的整倍体囊胚行FET后获得临床妊娠，产前诊断结果显示未见异常，足月剖宫产分娩一正常男婴，体重3 150 g，健康状况良好。

表1胚胎单体型连锁分析

表2 胚胎NGS PGD检测结果

讨 论

SMA于 1891 年由 Guido Werdnig 首次报告[9-10]，是一种以脊髓前角运动神经元退化变性为特征的常染色体隐性遗传病。根据其临床表现共分为4种亚型。目前，SMA的诊断方法主要包括血清肌酶谱检测、SMA病理特点、神经电生理特征、分子生物学检测[2]等。其中，SMA患者的血清肌酶谱检测能够与多数的肌源性疾病相区别，但这不能作为诊断SMA的唯一依据；而神经电生理检查虽然不是SMA的特异性指标，却作为一个重要的诊断指标，可以提高SMA患者基因诊断的阳性率；另外，肌肉活检是一种有创性检查，许多患者及家属对这种方法较为排斥，且不同亚型的SMA患者具有不同的病理特点，这就使得临床诊断困难[11-13]。因此，分子生物学检测对于疑似SMA的患者，尤其是Ⅰ、Ⅱ型患者，可依据患者的典型临床表现，将基因检测作为首选的诊断方法。对于临床表现不典型(尤其是Ⅳ型患者)，可将神经电生理和肌肉病理检查作为诊断的可靠依据，再结合基因诊断做进一步确诊。

SMA的致病基因即SMN基因，大小约38 000 bp，编码294个氨基酸，由这些氨基酸组成的蛋白高度保守，全身各部位均有表达，在脊髓运动神经元中的表达量最高[14-15]。该基因定位于5号染色体，由于所在的染色体区域内结构复杂，且存在着重复序列和众多假基因簇，导致其结构不稳定，极易发生基因的缺失、转换[16-18]。SMN基因有2个高同源性拷贝，一个是位于端粒侧的决定性基因SMN1基因；一个是位于着丝粒侧的修饰性基因SMN2基因。2个高同源性拷贝仅有 5 个碱基的差异，其中2个碱基分别位于7和8号外显子。SMA患者患病的主要原因是SMN1基因缺失，所占比例约为95%[19-20]。因此本中心采用Real-time PCR法检测SMN1基因，当发现这对夫妇的SMN1基因exon7均为单拷贝，而先证者为SMN1基因exon7纯合缺失时基本可以明确其患病原因，进而考虑采取PGD干预措施。

PGD技术是一种通过对体外受精形成的胚胎进行遗传物质分析，以诊断胚胎是否存在遗传异常，最终选择无遗传异常的胚胎植入宫腔，进而可以获得正常胎儿的诊断方法。PGD技术作为一种辅助生殖手段，有着明显的优势，比如能够有效地降低早期的流产率、新生儿缺陷的发生率以及胎儿的畸形率，可以使更多的家庭生育出健康的宝宝[21-22]。家族里已经生育过出生缺陷患儿的夫妇大多渴望优生优育，PGD技术可以从一定程度上满足这些夫妇的需求。但是，PGD技术也面临一些问题，比如操作繁琐，价格昂贵，且需要对胚胎进行侵入性操作以获得最终诊断。如何降低有创操作对胚胎造成的损伤还需要进一步探索，同时大样本的长期随访观察对子代的影响也是有必要的。

在本病例中先证者及其弟弟即为SMN1基因7号外显子纯和缺失突变致病，其父母均为杂合缺失。进行产前诊断选择终止妊娠3例患病胎儿。该夫妇为避免再次妊娠患病胎儿的风险，选择进行PGD，最终剖宫分娩一正常男婴。先证者由于7号外显子纯合缺失，使其无法表达有功能的全长SMN蛋白，从而对机体造成影响。由此可见，对于携带者的基因检测在遗传咨询及产前诊断中尤为重要。

目前，基于基因检测的特异性和无创性以及SMN相关基因位点精确的靶向分子描述，分子生物学检测逐渐成为确诊SMA的金标准。迄今为止，SMA作为一种遗传性神经肌肉疾病尚未有完善的治疗手段和预防方法。可以对计划怀孕的夫妇进行筛查，倘若夫妻双方都是携带者，可建议在孕中期通过羊水穿刺提取胎儿DNA，进行SMN基因检测，以明确胎儿是否为患者；也可选择通过PGD来生育一个健康的胎儿。基因检测可以为SMA家系提供遗传咨询及婚育指导，可进行有效的产前诊断，以减少患儿的出生。