黄亚，徐利，葛凤菊，祁秀娟，高晓艳

(上海永远幸妇科医院，上海 200131)

随着辅助生殖技术和玻璃化冷冻技术的发展，冻融单胚胎移植被越来越多的生殖中心所接受，尤其是冻融单囊胚移植，由于囊胚的发育潜能更佳、与内膜的同步性更好，移植成功率更高而备受关注[1-3]。但是人类胚胎在早期发育过程中，囊胚的形成时间并不一致，每一枚囊胚的质量也不尽相同，如何选择发育潜力最好的囊胚成为关键。而关于囊胚的形成时间，大多数生殖中心都是以发育天数为单位，一般以D5和D6囊胚为主，D7囊胚因质量较差被大多数生殖中心所废弃。本文将囊胚形成时间细化到小时，探讨囊胚形成时间对单囊胚FET周期妊娠结局的影响，同时结合囊胚质量，分析在囊胚质量不同的情况下，囊胚形成时间对临床结局的影响，以期为单囊胚FET选择策略提供依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2020年7月在我院生殖中心接受单囊胚FET的815个周期的临床资料。纳入标准：移植复苏后扩张的D5、D6、D7囊胚的单囊胚FET周期。排除标准：反复种植失败、子宫畸形、有宫腔病变、女方年龄>44岁以及失访的患者等。

二、研究方法

1.囊胚培养与评分：患者取卵日为第0天(D0)，第1天(D1)观察到双原核为正常受精，培养至第3天(D3)时将胚胎转移至囊胚培养液中，继续观察至第5～7天，根据囊胚形态及直径来决定是否进行冷冻。囊胚评分结合Gardner评分标准[4]及中华医学会专家指南共识：内细胞团(ICM)形态规则、大小均匀、融合且直径≥60 μm为A级；ICM形态不规则、大小不均、部分融合但直径≥60 μm为B级；ICM明显小于正常大小且细胞球数目极少为C级。滋养层细胞(TE)大小均匀、形态清晰且数目超过10个为A级；TE大小不均匀、部分形态清晰且细胞数目10个左右为B级；TE大小明显不均匀、形态不清晰、数目少于10个为C级。

2.分组：我中心观察囊胚时间一般为D5、D6和D7上午8：00左右，根据囊胚形成时间分为五组：≤118 h组(D5上午，306个周期)，(119～129)h组(D5下午，160个周期)，(130～142)h组(D6上午，264个周期)，(143～153)h组(D6下午，55个周期)，>153 h组(D7，30个周期)。如D5和D6囊胚直径≥160 μm或者D7囊胚直径≥180 μm，则进行冷冻；如D5和D6上午囊胚发育至2/3期，则于当天下午再次观察囊胚发育情况，达到冷冻标准则进行冷冻，并记录所有胚胎自授精之时起至达到冷冻标准时的发育时间。D7囊胚直径未达到180 μm则予以废弃。AA～CC所有符合直径标准的囊胚均采用玻璃化冷冻技术进行冷冻，冷冻的囊胚均为完全扩张期囊胚。将冷冻的囊胚细分为高质量囊胚组(G1，AA/AB/BA/BB)、普通囊胚组(G2，AC/CA/BC/CB)和低质量囊胚组(G3，CC)。

3.囊胚冷冻方法：囊胚冷冻前均进行激光辅助孵化皱缩。操作方法根据试剂盒(KITAZATO，日本)的标准操作程序，关闭操作台温度，待囊胚皱缩后放置ES液中，静置不超过15 min，再转入VS液中，混匀洗涤数次，90 s内放置在冷冻载杆的前端，迅速投入液氮中，套上套管，于液氮中保存。

4.囊胚解冻方法：收到临床医生通知后方可解冻。操作方法根据试剂盒(KITAZATO，日本)的标准操作程序，解冻前关闭操作台面温度，将装有囊胚的载杆从液氮迅速放入提前37℃预热的TS液中计时1 min，转入DS液中计时3 min，转入WS1液中计时5 min，WS2液中自然沉降两次后转入已经平衡好的囊胚培养皿中。激光辅助孵化，将囊胚透明带进行脱除，三气培养箱中培养至少3 h，待囊胚扩张后进行移植。

5.冻融囊胚移植：采用人工周期和自然周期准备内膜。(1)人工周期内膜准备方案：月经第3天开始口服雌二醇地屈孕酮片(芬吗通，雅培，荷兰)红片2 mg，3次/d，连服12 d；经阴道B超监测内膜厚度达到8 mm以上开始转化内膜，转化当天计为D0，开始口服雌二醇地屈孕酮片(芬吗通，雅培，荷兰)黄片2 mg，2次/d；D1开始同时黄体酮软胶囊(安琪坦，Besins，比利时)200 mg阴道用药，D5进行囊胚移植。(2)自然周期内膜准备方案：排卵日当天计为D0，D0开始口服地屈孕酮片(达芙通，雅培，荷兰)10 mg，3次/d，D5进行囊胚移植。移植后10 d查血βHCG。移植后4周进行B超检查，子宫腔内见孕囊或原始心管搏动为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期总数×100%；活产率=活产周期数/移植周期总数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、患者基础资料及不同发育时间囊胚妊娠结局比较

共纳入815个FET周期，患者平均年龄(34.23±4.81)岁，临床妊娠率47.48%(387/815)，活产率36.93%(301/815)。各组间基本资料(平均年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、移植日内膜厚度和周期方案)比较均无显著差异(P>0.05)。≤118 h组的临床妊娠率和活产率均显著高于其他四组(P<0.05)；(119～129)h组的临床妊娠率和活产率与(130～142)h组均无显著性差异(P>0.05)，但均显著高于(143～153)h和>153 h组的临床妊娠率和活产率(P<0.05)；(143～153)h组和>153 h组的临床妊娠率和活产率无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者基础资料及不同发育时间囊胚妊娠结局比较

二、不同级别不同发育时间囊胚的妊娠结局比较

根据囊胚级别，分为三个亚组，分析不同级别囊胚中发育时间对妊娠结局的比较。

1.高质量囊胚组(G1)不同发育时间囊胚的妊娠结局分析：G1组内各囊胚不同发育时间组间患者的基本资料(平均年龄、不孕年限、基础FSH、移植日内膜厚度)比较均无显著性差异(P>0.05)。≤118 h组的临床妊娠率显著高于(119～129)h组和(130～142)h组(P<0.05)，其他4组间临床妊娠率无显著差异(P>0.05)。各囊胚不同发育时间组间的活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同质量囊胚内不同发育时间结局比较

2.普通囊胚组(G2)不同发育时间囊胚的妊娠结局分析：G2组内各囊胚不同发育时间组间患者的基本资料(平均年龄、不孕年限、基础FSH、移植日内膜厚度)比较均无显著性差异(P>0.05)。各囊胚不同发育时间组间的临床妊娠率和活产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

3.低质量囊胚组(G3)不同发育时间囊胚的妊娠结局分析：G3组内各囊胚不同发育时间组间患者的基本资料(平均年龄、不孕年限、基础FSH、移植日内膜厚度)比较均无显著性差异(P>0.05)。≤118 h组的临床妊娠率显著高于(130～142)h组、(143～153)h组和>153 h组(P<0.05)，与(119～129)h组无显著性差异(P>0.05)，后3个发育时间段组间妊娠率均无显著性差异(P>0.05)；≤118 h组的活产率显著高于(143～153)h组和>153 h组(P<0.05)，除≤118 h组外其他4组间的活产率均无显著差异(P>0.05)(表2)。

讨 论

在冻融单囊胚FET周期中，囊胚形成时间是否会影响妊娠结局仍存在争议。多个研究结果显示，D5囊胚临床妊娠结局显著优于D6囊胚[5-8]。Wang等[9]认为，D5囊胚的植入率、临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚，但在新生儿出生体重、出生体长、低出生体重发生率和性别比等方面，D5组和D6组间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究将囊胚形成时间进行细化，分析后发现同样是D5形成的囊胚，D5上午囊胚(≤118 h组)的临床妊娠率和活产率最高，并显著高于其他4组(P<0.05)，而D5下午(119～129 h组)形成的囊胚与D6上午(130～142 h组)形成的囊胚其临床妊娠率和活产率均无显著差异(P>0.05)，D6下午(143～153 h组)形成的囊胚与D7(>153 h组)形成的囊胚其临床妊娠率和活产率亦无显著差异(P>0.05)。

在过去，D6未达到囊胚冷冻标准的胚胎都会被废弃。而越来越多的研究表明，D7形成的囊胚也具有一定的临床应用价值[10-12]。Ueno等[13]首次提出了D7囊胚冷冻标准，即直径达到180 μm即可冷冻，其妊娠结局显著高于移植D2胚胎的结局。本中心根据其提出来的冷冻标准，对D7直径达到180 μm及以上的囊胚进行冷冻，并在适宜条件下进行冻融移植。结果表明，D7囊胚(>153 h组)的临床妊娠率和活产率分别为23.33%(7/30)和16.67%(5/30)，与Ueno等[13]的研究结果类似，达到了可接受的临床结局。

低质量囊胚(CC级)因质量较差而被大多数生殖中心所废弃[14-15]，但是Li等[16]研究发现，移植CC级囊胚的临床妊娠率仍在可接受范围内，且新生儿结局与4BB级囊胚没有显著差异(P>0.05)。本中心研究表明，CC级囊胚依然有较大的临床应用价值[17]。因此本研究将CC级囊胚也纳入进来，结果发现：虽然低质量囊胚组中，随着囊胚形成时间的延长，临床妊娠率和活产率均呈现逐渐下降的趋势，但总的我院4CC级囊胚也达到了可接受的临床妊娠率为44.0%(45/171)，活产率为18.13%(31/171)。

研究发现，虽然D5囊胚临床妊娠率和活产率明显高于D6囊胚[18]，但优质囊胚在D5和D6移植的发育潜力是相当的[19-20]。当移植囊胚为非优胚时，囊胚形成时间对妊娠结局有显著影响，D5囊胚移植妊娠结局优于 D6囊胚[15，21]，本研究结果与之类似。

Zhang等[22]研究发现，优质囊胚组中D5囊胚的临床妊娠率和持续妊娠率显著高于D6囊胚，而非优质囊胚组则无显著性差异(P>0.05)。闫雪等[23]研究发现，移植D5和D6囊胚可达到相同的生化妊娠率、临床妊娠率、流产率及活产率。王雪等[24]研究发现，D5囊胚临床妊娠率显著高于D6囊胚，但是种植率和活产率没有显著性差异(P>0.05)。造成以上情况的原因可能是不同研究之间样本量有差异以及囊胚形成时间没有进一步细分。

本研究中，冷冻时间≤118 h组的囊胚临床结局最好，显著高于其他延迟发育的囊胚组。但是将囊胚按质量分组后，发现高质量囊胚组和普通囊胚组中，囊胚形成时间对活产率的影响并不大，而低质量囊胚组中≤118 h组的囊胚临床结局最好，因此在单囊胚移植时可优先选择D5上午形成的囊胚。但是鉴于本研究样本数量有限，关于囊胚形成时间和囊胚质量对妊娠结局的影响，还需要更大样本量、前瞻性研究验证。