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(广西食品药品检验所,广西南宁 530021)

凉茶是我国南方流行的一类饮料,是岭南人民根据本地的气候和水土特性,在长期预防疾病与保健过程中以中医养生理论为指导,以多种药食同源的中草药为基础,研制总结而来[1-3]。近年来,不法分子受利益驱使,向凉茶中非法添加化学药物,以提高其功效。由于化学药物有一定的副作用,大量或不正确的使用有可能导致严重后果,因此有必要加强对凉茶中非法添加化学药物的分析检测。国家对自制出售的凉茶尚未出台强制性标准,卫生及食药监管部门对凉茶监管尚属空白,建立简便、灵敏、快捷的方法来检查产品中是否非法添加化学药物具有重要的现实意义。

目前,凉茶中非法添加化学药物的检测已有报道,主要检测对象为解热镇痛类及抗菌药类化学药物[4-6]。本实验采用改进的QuEChERS方法[7-13]提取、净化样品,结合超高效液相色谱-串联质谱仪检测,建立宣称止咳平喘功效的凉茶中非法添加的10种化学药物的快速检测方法,以期为凉茶中非法添加药物的检测方法作出补充,为相关监管部门日常监督提供科学、客观的技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 6460型串联三重四极杆质谱,配Agilent1290型液相色谱仪 美国Agilent公司;Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司;Agilent SB-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm) 美国安捷伦公司。

8批实验样品 购于南宁,均宣称有止咳、化痰、平喘功效;醋酸泼尼松(Prednisone acetate)(纯度99.7%)、氢化可的松(Hydrocortisone)(纯度100.0%)、地塞米松(dexamethasone)(纯度99.8%)、枸橼酸喷托维林(pentoxyverine citrate)(纯度98.7%)、磷酸苯丙哌林(Benproperine Phosphate)(纯度99.8%)、盐酸溴己新(Bromhexine Hydrochloride)(纯度99.9%)、盐酸氨溴索(Ambmxol Hydochloride)(纯度99.9%);醋酸可的松(cortisone acetate)(纯度99.1%)、倍他米松(betamethasone)(纯度99.3%);布地奈德(budesonide)(纯度99.4%) 以上对照品均购自中国生物制品检定研究院;甲醇、乙腈、甲酸 均为色谱纯,美国Fisher公司;乙酸铵、氯化钠、无水硫酸镁 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;水 超纯水,实验室自制;C18吸附剂、乙二胺基-N-丙基吸附剂(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附剂、氨丙基(NH2)吸附剂 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 精密称取各标准品10.0 mg,分别置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成浓度为400 mg/L的标准储备液,在-18 ℃储存。使用时根据需要吸取适量的各标准储备液混合,用甲醇稀释成质量浓度为1.0 mg/L的混合标准工作液,于-18 ℃下储存。

1.2.2 样品处理 准确移取样品5.00 mL(精确至0.01 mL)于15 mL聚丙烯塑料离心管中,加入5.00 mL乙腈,涡旋1 min后加入0.5 g无水MgSO4和2.0 g NaCl,涡旋混匀,5000 r/min离心5 min,收集上清液于另一15 mL离心管中(已加入100 mg C18),涡旋2 min,5000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Agilent SB-C18 Column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm);流动相:A为乙腈,B为10 mmol/L醋酸铵溶液(含0.1%甲酸),梯度洗脱程序:0～5 min,30% A;5～19 min,30% A→60% A;19～20 min,60% A→30% A;20～25 min,30% A。流速:0.5 mL/min;进样量:5 μL;柱温:35 ℃。

1.2.4 质谱条件 电喷雾离子源(ESI);正离子扫描;多反应监测(MRM);毛细管电压:3500 V;干燥气温度(TEM):350 ℃;干燥气流速:5 L/min;鞘流气温度:350 ℃;鞘流气流速:10 L/min;雾化气压力:40 psi;质谱采集参数见表1。

表1 10种化学药物质谱参数Table 1 Parameter of mass spectra of 10 chemical drugs

1.3 数据处理

采用MassHunter数据处理系统(美国Agilent公司)采集数据、命名及积分,Microsoft Excel 2010(美国微软公司)进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

液相色谱仪接两通,色谱条件为50%甲醇溶液作为流动相,流速为0.3 mL/min,进样量为1 μL,采用各组分的储备溶液以单针进样的方式,分别在正、负离子模式下,对各待测化合物进行全扫描,以选择合适的电离方式和准分子离子。各待测化合物在正电离模式下得到各自的准分子离子[M+H]+,再对各准分子离子产生的子离子及子离子的碎裂电压和碰撞能量进行优化选择,以两个相对丰度最高的特征离子作为定性离子,并以其中相对丰度较高的子离子作为定量离子,最终确定的质谱参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

试验中考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.01 mol/L乙酸铵溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.01 mol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)-乙腈等流动相体系对10种化学药物的色谱峰形、分离度以及信号强度的影响。通过比较发现,水-乙腈、0.01 mol/L乙酸铵溶液-乙腈系统中,大部分化合物峰形拖尾,且信号强度低;含有甲醇体系的流动相会促使大部分化合物色谱峰拖尾、峰形钝化;0.1%甲酸水溶液-乙腈系统中盐酸溴己新、枸橼酸喷托维林、磷酸苯丙哌林的峰形分叉。选择0.01 mol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)-乙腈作为流动相,10种化学药物的分离效果更好、信号强度相对更高,因此选择该系统作为流动相。

梯度洗脱条件的优化:经过反复试验,改变不同时间段流动相中有机相和水相的比例,最终确定了最佳梯度洗脱程序:0～5 min,30%乙腈;5～19 min,30%乙腈→60% 乙腈;18～19 min,60% 乙腈→30% 乙腈;0～5 min,30%乙腈。10种化学药物的总离子流色谱图见图1。

图1 10种化学药物混合标准溶液(0.05 mg/L)的LC-MS/MS色谱图Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of a mixed standard solution of the 10 chemical drugs(0.05 mg/L)注:1:氨溴索;2:氢化可的松;3:地塞米松;4:倍他米松; 5:盐酸溴己新;6:枸橼酸喷托维林;7:醋酸泼尼松; 8:醋酸可的松;9:磷酸苯丙哌林;10:布地奈德。

2.3 提取溶剂的选择

凉茶一般为中草药的水溶液提取物,含有大量亲水性的成分,如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、生物碱盐及苷类等,基质复杂,因此需要采用适当的提取和净化方式对样品进行处理,以便尽可能的减少干扰,提高分析灵敏度。本实验比较了乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用提取溶剂的提取效果,经过观察发现,乙腈提取液中色素较少,故选用乙腈作为提取溶剂。

2.4 吸附剂种类和用量的选择

QuEChERS方法中,PSA、C18、NH2和GCB是常见的吸附剂。本实验考察了十八烷基硅烷键合硅胶吸附剂(C18)、乙二胺基-N-丙基吸附剂(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附剂、氨丙基(NH2)吸附剂(加入量均为100 mg)的提取效果,随着GCB的加入,大部分化合物均无信号。PSA与NH2作为吸附剂时氨溴索、地塞米松与倍他米松的回收率均低于80%,采用C18时,10种化学药物的回收率均能达到80%以上(图2),因此选择C18作为吸附剂。

图2 吸附剂对10 种化学药物回收率的影响Fig.2 Effect of adsorbent on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.5 除水剂用量的选择

实验中加入过饱和的无水MgSO4和NaCl可促使有机相与水相分层,减少共提物,提高目标物的提取效率。同时,本实验还对两者的用量进行了优化。在固定无水MgSO4的加入量为0.5 g时,考察了NaCl在1.0～2.5 g的使用范围内的提取效果,结果当NaCl用量在2.0 g时,各化合物的回收率均达到最大(图3);确定NaCl用量后,考察了无水MgSO4在0.5～2.0 g的使用范围内的提取效果,结果无水MgSO4使用量对回收率影响不大(图4)。因此,本实验无水MgSO4和NaCl的最佳加入量分别为0.5、2.0 g。

图3 氯化钠用量对10 种化学药物回收率的影响Fig.3 Effect of dosage of NaCl on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

图4 无水硫酸镁用量对10 种化学药物回收率的影响Fig.4 Effect of dosage of MgSO4 on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.6 方法的线性关系、检出限、回收率和精密度

取混合标准工作液用甲醇配制成系列标准溶液,分别进样进行测定,以各组分的质量浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,线性范围、线性方程和相关系数见表2。结果10种化学药物在各自的质量浓度范围内,峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9984～0.9999。

表2 10种化学药物的线性范围、线性方程、相关系数(r)和检出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation and LOD of the 10 chemical drugs

在阴性凉茶样品中添加不同浓度的待测物,按本研究建立的方法进行检测,以信噪比S/N=3计算方法的检出限,10种化学药物的检出限在0.1～3.0 μg/L之间。

取阴性凉茶样品,分别添加3个浓度水平的10种待测化合物,每个水平测定3份平行样品,考察方法的回收率和精密度。结果见表3。从中可以看出,各化合物在3个加标水平的平均回收率为67.1%～108.5%,相对标准偏差(RSD)为0.2%～6.9%。

表3 阴性凉茶样品中10种化学药物的加标回收率与相对标准偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the 10 chemical drugs in a blank sample(n=3)

2.7 实际样品的测定

从南宁市场购买的8份凉茶样品,采用本研究建立的多组分检测方法进行测定。结果均未检出上述化学药物。

3 结论

将QuEChERS前处理方法应用于凉茶中非法添加化学药物的检测,通过对QuEChERS前处理方法及仪器色谱条件的优化,建立了定性、定量测定凉茶中氨溴索、氢化可的松、地塞米松、倍他米松、盐酸溴己新、枸橼酸喷托维林、醋酸泼尼松、醋酸可的松、磷酸苯丙哌林、布地奈德等10种非法添加的止咳平喘类化学药物的检测方法。该方法操作简便、灵敏度高,10种待测物在各自的浓度范围内,线性关系良好,相关系数均不小于0.9984,检出限为0.1～3.0 μg/L,在三个不同添加水平下的平均回收率为67.1%～108.5%,相对标准偏差(RSD)为0.2%～6.9%。该方法操作简单,净化效果好，灵敏度高,对凉茶基质净化效果好,可用于凉茶中10种非法添加的止咳平喘类化学药物的快速筛查和测定。